Middle-down Analysis of Monoclonal Antibody Middle using Nano-flow Liquid Chromatography and a Novel Tribrid Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

V biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu jsou monoklonální protilátky klíčovými léčivými proteiny. Jejich přesná charakterizace na úrovni podjednotek umožňuje odhalit strukturu, modifikace a glykoformy, což je zásadní pro kvalitu a účinnost terapeutických produktů.

Cíle a přehled studie

Studie si kladla za cíl vyvinout citlivou middle-down metodiku pro analýzu monoklonální protilátky rozštěpené na podjednotky. Použito bylo nano-průtokové kapalinové chromatografie v kombinaci s novým Orbitrap Fusion Tribrid MS a komplementárními disociačními technikami HCD a ETD.

Použitá metodika a instrumentace

• Enzymatické štěpení protilátky v místě disulfidického pantu (FabRICATOR®/IdeS) na F(ab')2 a dvě části Fc.
• Redukce a denaturace fragmentů v prostředí dithiothreitol/denaturační činidla.
• Nano-LC s PepSwift monolitickou kolonkou (200 µm × 25 cm) a EASY-nLC 1000 systémem, gradient 5–60 % acetonitrilu s 0,1 % HCOOH, 800 nl/min.
• Orbitrap Fusion Tribrid MS: plný scan 240 000 (m/z 400–2000) pro fragmenty, 15 000 (m/z 1000–6000) pro intact, HCD i ETD disociace, AGC 1e5, injekční čas 100 ms, teplota 300 °C.
• Data processing: Protein Deconvolution 3.0, Xtract pro dekonvoluci isotopických vzorků, ProSightPC 3.0 pro middle-down interpretaci.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intact protilátka a podjednotky byly úspěšně separovány a analyzovány LC-MS. Dekonvoluce odhalila přesné hmotnosti intact protilátky a fragmentů s přesností ~2 ppm.
• Isotopické rozlišení ~25 kDa fragmentů umožnilo jednoznačné určení monoisotopických hmotností light chain (23113,3568 Da) a Fc/2 glykoform G1F.
• Komplementární ETD a HCD disociace poskytly průměrné sekvenční pokrytí ~50 % pro light chain, 52 % pro Fc/2 s G0F a 32 % pro Fd'.
• ETD fragmenty C57 a C61 potvrdily lokalizaci glykozylace G0F na reziduu Asn61 ve Fc/2, i při nízké intenzitě fragmentů.
• Objevena N-terminální modifikace pyroglutamátu Fd' a ztráta C-terminálního lysinu ve Fc/2.

Přínosy a praktické využití metody

Metodika poskytuje vyvážené informace o intact proteinu i jeho podjednotkách, zachovává citlivost pro labile PTM (např. glykozylaci) a nabízí rychlou charakterizaci kritických kvalitativních parametrů mAb.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zlepšení sekvenčního pokrytí kombinací alternativních disociačních metod a vyššího rozlišení MS.
• Rozšíření middle-down přístupu na další bioterapeutické proteiny a komplexní biomolekulární komplexy.
• Automatizace datové analýzy a integrace výsledků do platformy pro kontrolu kvality (QA/QC) v GMP prostředí.

Závěr

Middle-down LC-MS metodika na Orbitrap Fusion Tribrid MS se ukázala jako výkonný nástroj pro detailní charakterizaci monoklonálních protilátek. Komplementární HCD/ETD disociace umožnila identifikaci PTM i sekvenčních variací, což přispívá ke zvýšení spolehlivosti a kvality terapeutických mAb.

Reference

Nejsou uvedeny žádné explicitní literární odkazy ve vstupním materiálu.