Optimizing plant phosphoproteomic data independent acquisition: micro-pillar array columns and traditional packed bed technology

Význam tématu

Studium fosfoproteomu rostlin je klíčové pro pochopení regulačních mechanismů, které řídí odpověď na vnější podmínky a růstové podněty. Nízká abundance fosfoproteinů a jejich nízká ionizační účinnost kladou vysoké nároky na citlivost a reprodukovatelnost analýzy. Optimalizace chromatografických kol a akvizičních metod ve spojení s data-independent acquisition (DIA) je proto zásadní pro zvýšení pokrytí i u stopových fosfopeptidů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem publikace bylo porovnat výkonnost tradičních perovaných kol s micro-pillar array (µPAC) sloupci při krátkých 15minutových DIA bězích na vzorcích z Arabidopsis thaliana. Autoři sledovali rozsah identifikací fosfoproteinů a peptidů, tvar chromatografických vrcholů a citlivost při nízkých koncentracích.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit systém Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC s kolony:

• Double nanoViper PepMap Neo UHPLC 75 µm × 15 cm (DNV75150PN)
• Double nanoViper PepMap Neo UHPLC 150 µm × 15 cm (DNV150150PN)
• 50 cm µPAC Neo HPLC (COL-NANO050NEOB)
• 5,5 cm High Throughput µPAC Neo HPLC (COL-CAPHTNEOB)

Separace probíhala při 50 °C s gradientem 4–40 % ACN/FA (0,1 %) během 11,8 min, běžně při průtoku 1,5 µl/min (50 cm µPAC 0,8 µl/min). Analýza probíhala na Orbitrap Astral MS s dua­lním režimem skenů (full scan 240 000 rozlišení, DIA Thompson okna 380–980 m/z).

Hlavní výsledky a diskuse

Tradiční perované kolony vykázaly vyšší počet identifikovaných fosfoproteinových skupin a fosfopeptidů při plné proteomické náloži. µPAC kolony přinesly výrazně vyšší intenzity pro nízkointezivní peptidy, ale při vysokém zatížení mohlo docházet k přetížení povrchu. Profil tvaru vrcholů byl u perovaných kol lepší s menší asymetrií, zatímco µPAC sloupce vykázaly užší šířky vrcholů pro slabě zastoupené analyty. Krátkodobé high-throughput běhy se jeví jako vhodné pro DIA analýzu fosfoproteomu.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost při detekci nízkoabundantních fosfopeptidů pomocí µPAC
• Širší proteomová pokrytí na perovaných kolonech při vyšší náloži
• Rychlé 15minutové DIA běhy vhodné pro vysokopropustné aplikace
• Možnost volby sloupce podle analytického cíle: citlivost vs pokrytí

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na integraci pokročilých mikrostruktur kol s optimalizovanou povrchovou úpravou pro snížení přetížení při analytických náložích. Kombinace µPAC technologií s inteligentními vyhledávacími algoritmy a rozšířeným rozsahem DIA oken může dále zlepšit kvantitativní hloubku analýzy fosfoproteomu.

Závěr

Srovnání perovaných a micro-pillar array kolon odhalilo komplementární výhody: perované kolony nabízejí vyšší celkové pokrytí, µPAC pak lepší citlivost na nízkou abundanci. Volba vhodného sloupce a krátký DIA protokol umožňují aplikaci v plant proteomice, kde je klíčová rychlost i citlivost.

Reference

• Leutert et al. 2019. SP3 bead-based proteome sample preparation.
• Mehta et al. 2022. Zefektivnění fosfoproteinové analýzy pomocí IMAC HP.