IEX-MALS - a method for protein separation and characterization

Význam tématu

Ion-exchange chromatography spojená s multiúhlovým rozptylem světla (IEX-MALS) nabízí přesné určení molární hmotnosti a velikosti proteinů, jejich komplexů a peptidů v heterogenních směsích. Metoda překonává omezení běžně používaného SEC-MALS tam, kde sloupcová velikostní exkluze nedokáže rozlišit např. izoformy či varianty proteinu. Díky vysoké selektivitě separace podle povrchového náboje je IEX-MALS klíčová pro kontrolu kvality bioterapeutik, identifikaci modifikovaných forem a stanovení složení složitých vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představují metodiku IEX-MALS jako nástroj pro:

• absolutní stanovení molární hmotnosti a hydrodynamického poloměru proteinů,
• odlišení a kvantifikaci proteových oligomerů a posttranslačních modifikací,
• charakterizaci monoklonálních protilátek (mAb) a bovinního sérového albuminu (BSA).

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy proběhly na systému AKTA pure FPLC s UV detektorem (280 nm), miniDAWN MALS a vestavěným QELS DLS detektorem. Pro koncentraci vzorku byla použita optická detekce UV a v závislosti na profilu soli i diferenciální refraktometr Optilab dRI. Data zpracovávalo softwarové prostředí ASTRA.

Hlavní výsledky a diskuse

• BSA – monomer, dimery a trimery se separují lineárním či stupňovitým salinickým gradientem; optimální rozlišení dimerních forem a fragmentů bylo dosaženo kombinací krokového a gradientového eluce.
• mAb1 a mAb2 – metodou SEC-MALS se jeví jako homogenní monomery, zatímco CIEX-MALS odhaluje a separuje lehké rozdíly v poplatcích (acidické/ bazické varianty), které vykazují shodné molární hmotnosti a velmi podobné hydrodynamické poloměry.

Přínosy a praktické využití metody

IEX-MALS umožňuje:

• přímou a absolutní charakterizaci molekulové hmotnosti bez kalibrace sloupce,
• rozlišení izoformních a nabíjecích variant bioterapeutik,
• analýzu vzorků, které nelze adekvátně separovat velikostní exkluzí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• rozšíření IEX-MALS na preparativní kolony pro optimalizaci purifikačních procesů,
• kombinace s dalšími orthogonálními technikami separace (např. afinitní chromatografií),
• aplikace na velké biomolekuly jako IgM, virus-like particle nebo nanodisky.

Závěr

IEX-MALS představuje výkonné doplňkové řešení k SEC-MALS pro detailní analýzu proteinů a jejich variant. Díky vysoké citlivosti a selektivitě separace podle náboje je metoda vhodná pro kontrolu kvality bioterapeutik, identifikaci jemných variant a analýzu složitých biologických směsí.

Reference

1. Wyatt P. J. Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Anal Chim Acta. 1993;272.
2. Folta-Stogniew E., Williams K. R. Determination of molecular masses of proteins in solution: HPLC-SEC and laser light scattering. J Biomol Tech. 1999;10:51–63.
3. Amartely H., Avraham O., Friedler A., Livnah O., Lebendiker M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS). Sci Rep. 2018;8:6907.
4. Khawli L. A. et al. Charge variants in IgG1. MAbs. 2010;2:613–624.
5. Du Y. et al. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. MAbs. 2012;4:578–585.