Identification of Amino Acid Isomers Using Electron Capture Dissociation in the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF System

Význam tématu

Identifikace izobarických aminokyselin, zejména Leucin/Isoleucin a Aspartát/isoAspartát, je klíčová pro přesné určení primární struktury proteinů a jejich biologické funkce. Rozlišení těchto izomerů je zásadní v oblasti vývoje biologických léčiv, charakterizace protilátek a studia molekulárních změn souvisejících s nemocemi či stárnutím proteinů.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo demonstrovat schopnost systému Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF vybaveného ExD buňkou pro Electron Capture Dissociation (ECD) spolehlivě rozlišit izobarické aminokyseliny v peptidech a intaktních proteinech. S využitím ExDViewer softwaru byla analyzována bohatá boční řetězcová fragmentace a sekundární štěpení, která poskytují diagnostické w-ionty a změny hmotnosti c/z iontů pro detekci isoAsp.

Použitá metodika a instrumentace

• Chemikálie a standardy: syntetický peptid REALLYisoD, bovinní ubiquitin, melittin/tune mix, acetonitril a formiová kyselina v LC/MS kvalitě.
• Příprava vzorků: lyofilizované vzorky rekonstituovány v 15 % acetonitrilu s 0,01 % formiové kyseliny (1 µM peptide, 10 µM ubiquitin).
• Infuze vzorků: přímá infuze pomocí injekční stříkačky s PEEK trubicí do Dual Jet Stream ESI zdroje při 20 µL/min.
• Instrumentace: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s ExD buňkou (G1997AA).
• Software: MassHunter Acquisition v11.0, ExDControl v3.6 pro ovládání ExD buňky a ExDViewer v4.5.14 pro anotaci fragmentů.
• Parametry MS: pozitivní ionizace, teplota plynu 325 °C, fragmentor 175 V, izolace 9 m/z, sběr MS1 a MS2 spekter do 3 200 m/z.

Hlavní výsledky a diskuse

• Peptid REALLYisoDELIGHTFLK:

• ECD generovalo boční řetězcové w-ionty s charakteristickou ztrátou 43 Da pro Leu a 29 Da pro Ile, umožňující jejich jednoznačné rozlišení.
• IsoAsp detekováno jako posun c iontu o +57 Da a z iontu o –57 Da.
• CID fragmentace neposkytuje dostatečné diagnostické živly pro rozlišení izobarů.
• Zkouška kolizní aktivace před ECD ukázala snížení intenzit diagnostických iontů při vyšších energiích; optimálním přístupem je přímé ECD bez předchozí aktivace.

• Top-down analýza ubiquitinu:

• Intaktní ubiquitin (11+ prekurzor) fragmentován v ExD buňce, dosaženo 99% pokrytí sekvence.
• Rozlišeno 10 z 16 párů Leu/Ile a detekovány isoAsp pozice 39 a 52.
• ExDViewer umožňuje interaktivní prozkoumání jednotlivých fragmentů a potvrzení izobarické identifikace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje robustní a vysoce citlivý přístup k rozlišení izobarických aminokyselin přímo v MS/MS spektrech. Uplatnění nachází ve farmaceutickém výzkumu a kontrole kvality biologických léčiv, v proteomických studiích zaměřených na modifikace proteinů a v základním výzkumu struktury a funkce proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj automatizovaných algoritmů pro vyhodnocení ECD dat, zvýšení hmotnostního rozlišení Q-TOF systémů a rozšíření aplikací na komplexní proteomové studie. Pokročilé softwarové nástroje a integrace s AI analýzou mohou dále zrychlit a zpřesnit identifikaci izobarických zbytků v rozsáhlých datových souborech.

Závěr

Systém Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF vybavený ExD buňkou ve spojení se softwarem ExDViewer nabízí efektivní řešení pro jednoznačné rozlišení izobarických aminokyselin v peptidech a intaktních proteinech. Metoda kombinuje vysokou citlivost, rozsáhlé pokrytí sekvence a snadnou interpretaci dat, čímž významně rozšiřuje možnosti rutinní a výzkumné proteomiky.

Reference

1. Kjeldsen F., Haselmann K. F., Sørensen E. S., Zubarev R. A. Distinguishing of Ile/Leu Amino Acid Residues in the PP3 Protein by (Hot) Electron Capture Dissociation in Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2003, 75(6), 1267–1274.
2. Wakankar A. A., Borchardt R. T., Eigenbrot C., Shia S., Wang Y. J., Shire S. J., Liu J. L. Aspartate Isomerization in the Complementarity-Determining Regions of Two Closely Related Monoclonal Antibodies. Biochemistry 2007, 46(6), 1534–1544.
3. Wang J., Mukherjee S., Zubarev R. A. Isoaspartate and Neurodegeneration. Aging 2022, 14(22), 8882–8883.
4. Geiger T., Clarke S. Deamidation, Isomerization, and Racemization at Asparaginyl and Aspartyl Residues in Peptides. J. Biol. Chem. 1987, 262(2), 785–794.
5. Yang H., Zubarev R. A. Mass Spectrometric Analysis of Asparagine Deamidation and Aspartate Isomerization in Polypeptides. Electrophoresis 2010, 31, 1764–1772.
6. Han H., Xia Y., McLuckey S. A. Ion Trap Collisional Activation of c and z• Ions Formed via Gas-Phase Ion/Ion Electron-Transfer Dissociation. J. Proteome Res. 2007, 6(8), 3062–3069.
7. Beckman J. S., Voinov V. G., Hare M., Sturgeon D., Vasilev Y., Oppenheimer D., Shaw J. B., Wu S., Glaskin R., Klein C. et al. Improved Protein and PTM Characterization with a Practical Electron-Based Fragmentation on Q-TOF Instruments. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2021, 32(8), 2081–2091.