Automated sample introduction method for high-throughput intact native protein analysis using collision induced unfolding coupled with drift-tube ion mobility-mass spectrometry

Význam tématu

Analýza nativních bílkovin pomocí kolizně indukovaného unfoldingu (CIU) spárovaného s iontovou mobilitou a hmotnostní spektrometrií (IM-MS) umožňuje získat jedinečné strukturální otisky bílkovin v plynném stavu. Metoda kombinuje přesné měření kolizního průřezu (CCS) s řízeným rozvinutím proteinových konformací, čímž se zvyšuje selektivita při identifikaci a charakterizaci různých bílkovin a komplexů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout plně automatizovanou metodu pro vysokoprůchodovou (high-throughput) analýzu nativních intactních bílkovin pomocí CIU-IM-MS. Klíčovým prvkem bylo začlenění středněobjemové (mikrolitrové) flow injection aplikace do stávající LC-MS platformy Agilent, aby byla minimalizována spotřeba vzorku a zvýšena opakovatelnost měření.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky (BSA, HSA, monoklonální protilátky IgG) byly připraveny v 100–200 mM roztoku uhličitanu amonného a desalting proveden pomocí Bio-spin P-6 kolonek. Instrumentace zahrnovala:

• Agilent 6560C IM-QTOF s In-Source ion activation hardware
• Agilent 1290 Infinity II LC se 40 µL vzorkovou smyčkou a 40 µL dávkovačem
• 100 psi regulátor zpětného tlaku (IDEX Health & Sciences)
• Flow injection gradienty 5–35 µL/min s 5 mM uhličitanem amonným
• CIUSuite 2.3 pro zpracování CIU dat

Hlavní výsledky a diskuse

Opakovatelnost CIU experimentů byla hodnocena na BSA a HSA, kde střední RMSD hodnoty CCS otisků dosahovaly 2–4 % pro nábojová stavy +16 až +19. Pro protilátky IgG se podařilo analyzovat vzorky během 1,75–3,8 minuty s RMSD pod 6 % a úspěšnou klasifikací variant pomocí CIUSuite (přesnost >90 %). Automatizovaná flow injection metoda minimalizovala manuální zásahy a zabránila hromadění solí díky jednorázovému blank běhu po každém vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy nativních bílkovin
• Automatizace vzorkování zvyšuje reprodukovatelnost
• Spotřeba vzorku v mikrogramových množstvích
• Unikátní CIU otisky pro spolehlivou identifikaci proteinových variant

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace CIU-IM-MS do rutinního QA/QC průmyslové a farmaceutické analýzy, rozšíření softwarové podpory pro vyšší stupeň automatizované klasifikace a aplikace na komplexní biologické systémy včetně virových proteinů a velkých proteomických komplexů.

Závěr

Studie ukazuje, že Agilent 6560C IM-QTOF s flow injection modulem představuje robustní nástroj pro vysokoprůchodovou CIU analýzu nativních bílkovin a protilátek. Automatizovaná metoda umožňuje spolehlivou identifikaci a charakterizaci proteinových konformací s nízkou spotřebou vzorku a vysokou reprodukovatelností.

Reference

1 Vallejo D. D. et al., Anal. Chem. 2019, 91, 8137–8146
2 Gadkari V. V. et al., Anal. Chem. 2020, 92, 15489–15496
3 Eschweiler J. D. et al., Anal. Chem. 2015, 87, 11516–11522