A semi-automated workflow for targeted LC/MS analysis of circulating bile acids in plasma samples

Význam tématu

Biliární kyseliny jsou nezbytné pro vstřebávání lipidů a udržení energetické homeostázy. Cirkulující hladiny v plasmě reflektují funkci jater a metabolický stav organismu. Nízké koncentrace při patologických stavech vyžadují citlivé analytické přístupy pro spolehlivou detekci.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo navrhnout semiautomatizované workflow pro cílenou kvantifikaci 20 klíčových biliárních kyselin v plasmě. Studie využila nový Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/TQ s iFunnel technologií pro zvýšení citlivosti a zjednodušení vývoje metody.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie na Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.1×50 mm, 1.9 µm, 50 °C.
• Gradientní eluce 25–98 % acetonitrilu s 0.1 % formiové kyseliny v průtoku 0.5 mL/min během 13 minut.
• Spektrometrie Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/TQ s iFunnel technologií, ESI negativní režim, dynamic-MRM akvizice.
• MassHunter 12.0 pro automatizovanou optimalizaci parametrů a kvantifikaci.
• Příprava vzorků: precipitace proteinů metanolem s deuterovanými interními standardy, centrifugace, odpaření pod sníženým tlakem a rektifikace v MeOH:H2O (1:1).

Hlavní výsledky a diskuse

• Separační metoda zajistila rozlišení všech 20 kyselin s lineární kalibrací (0.1–1000 ng/mL) a R2 > 0.99.
• Reprodukovatelnost interních standardů (%RSD) < 10 % při 50 opakovaných injekcích.
• Detekce biliárních kyselin v plazmě laboratorních potkanů a myší na úrovni fg.
• Hierarchická shluková analýza ukázala zvýšení hladin CA, α-MCA a HDCA v plazmě krys.

Přínosy a praktické využití metody

• Poloprofesionální workflow minimalizuje manuální kroky a riziko chyb.
• Vysoká citlivost a selektivita umožňují sledování stopových koncentrací v biologických matricích.
• Metodu lze uplatnit v préklinických studiích, toxikologickém výzkumu a diagnostice biomarkerů.
• Intuitivní software a možnost automatizace usnadňují integraci do rutinních QA/QC laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření spektra analyzovaných metabolit o doplňující lipidy a polaritní sloučeniny.
• Plná automatizace přípravy vzorků pro vysokopropustné analytické platformy.
• Propojení s pokročilými chemometrickými nástroji a strojovým učením pro hlubší interpretaci dat.
• Aplikace v klinických studiích zaměřených na metabolické onemocnění a toxikologii.

Závěr

Studie představuje účinné a robustní semiautomatizované LC-MS/MS řešení pro cílenou analýzu biliárních kyselin v plasmě. Vysoká citlivost i reprodukovatelnost metody otevírá cestu pro rutinní a výzkumné aplikace v biomedicíně a farmaceutickém vývoji.

Reference

• Van de Bittner GC et al An Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation Workflow for Mammalian Cell Samples Agilent Technical Overview 5994-5065EN 2022
• Sartain M et al Enabling Automated Low-Volume Plasma Metabolite Extraction with the Agilent Bravo Platform Agilent Application Note 5994-2156EN 2020