Tools to Understand the Gut Microbiome: A Refined LC-MS/MS Method to Profile Bacteria-derived Bile Acids

Význam tématu

• Secondary bile acids představují nejhojnější a nejproměnlivější metabolity střevní mikrobioty.
• Ovlivňují hostitelskou fyziologii, přičemž jejich složení, biologické funkce a producenti zůstávají částečně neznámí.
• Rozvoj cílených LC-MS/MS metod nabízí rychlejší a méně náročnou alternativu k tradičním GC-MS přístupům.

Cíle a přehled studie / článku

• Vyvinout robustní LC-MS/MS metodu pro profilování a kvantifikaci 26 bakteriálních žlučových kyselin s minimální přípravou vzorku.
• Zajistit vysokou selektivitu, citlivost a reprodukovatelnost v biologických matricích.
• Optimalizovat chromatografickou separaci isomerů a snížit postupem akumulaci lipidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: 26 standardů, homogenizace a extrakce střevních pelet a NIST SRM 1950 plasmy v metanolu a vodě.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II UHPLC s Poroshell EC-C18 kolónou; mobilní fáze A 0.1% HCOOH a 20 mM octanu amonného ve vodě, B 0.1% HCOOH v acetonu; gradient 32 až 98% B v 32,1 min.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6470 Triple Quadrupole s Jet Stream ESI, positivně/negativně, dynamic MRM, 110 tranzic, optimalizované parametry (doba cyklu 750 ms, napětí 4500 V/3000 V).

Hlavní výsledky a diskuse

• MRM režim (M+NH4)+ poskytl vyšší selektivitu než SIM, podobné limity detekce a lepší potlačení matricových interferencí.
• Aceton jako mobilní fáze B účinně odstraňoval fosfolipidy a triacylglyceroly ve srovnání s acetonitrilem.
• Optimální gradient zajistil bazální rozlišení 24 z 26 žlučových kyselin a částečné rozdělení Tauro α/β-MCA.
• Robustnost prokázána 200 injekcemi myšího kekoálního extraktu: CV oblasti ~2.7% a CV retenčního času <0.12% po 4 dnech nepřetržitého provozu.
• Sensitivita s LLOQ v rozmezí 0.2–5 nM, dynamický rozsah 4 řády, kalibrační křivky R2>0.99.
• Profilování odhalilo odlišné složení žlučových kyselin v gnotobiotických a klasicky chovaných myších a v plasmatických vzorcích.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita a citlivost v komplexních biologických matricích.
• Minimální příprava vzorku a vynikající opakovatelnost retence.
• Vhodné pro vysokopropustné studie mikrobiomu, farmakokinetiky a QA/QC v průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu o nové žlučové kyseliny a deriváty.
• Integrace s lipidomikou a metabolomikou pro komplexní biochemické profily.
• Propojení s genomickými a metagenomickými daty pro objasnění genové regulace produkce.
• Potenciál pro klinické biomarkery a automatizované platformy.

Závěr

Reference

1. Devlin A.S., Fischbach M.A. Nature Chemical Biology. 2015 Sep;11(9):685-90
2. Wegner K. et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2017 Feb;409(5):1231-1245