A Novel, High-Accuracy Glucose-Unit Based N-glycan Retention Library and Peak Assignment Tool for Compound Identification in LC or LC/MS Data

Význam tématu

Glykozylace je klíčová posttranslační modifikace, která ovlivňuje stabilitu, biologickou aktivitu a farmakokinetiku proteinových bioterapeutik. Spolehlivé sledování N-glykanových profilů je v biopharmaceutickém průmyslu nezbytné, avšak díky komplexní struktuře a izomerii glykánů představuje značnou analytickou výzvu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout vysoce přesnou knihovnu retenčních časů normalizovaných na glukózové jednotky (GU) pro InstantPC a 2-AB značené N-glykany a vytvořit webový nástroj Glycan Peak Assignment Tool pro automatické přiřazení glykánových struktur v datech LC/FLD a LC/Q-TOF. Nástroj využívá interní GU knihovnu 115 InstantPC a 105 2-AB N-glykanů a nabízí volitelnou funkci zpřesnění predikce.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: N-glykany uvolněné z monoklonální protilátky cetuximab (Erbitux) a referenční InstantPC/2-AB značená směs.
• Chromatografie: Agilent 1290 Bio Infinity II LC/FLD s kol. AdvanceBio Amide HILIC (2.1×150 mm, 1.8 μm, 60 °C); mobilní fáze A: 50 mM ammonium formiát pH 4.4, B: acetonitril; průtok 0.6 mL/min; gradienty 60 a 90 min; fluorescenční detekce InstantPC Ex 285 nm/Em 345 nm, 2-AB Ex 260 nm/Em 430 nm.
• Hmotnostní spektrometrie: 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF; drying gas 150 °C/9 L/min, sheath gas 300 °C/10 L/min, nebulizér 35 psi, Vcap 2500 V, nozzle 500 V, režim 2 GHz, m/z do 3200.

Hlavní výsledky a diskuse

Predikované retenční časy pro InstantPC značenou referenční směs vykázaly chybu pod 2 %, při zapnutí funkce zpřesnění pod 1 %. U více kandidátních struktur slouží MS data k jednoznačné verifikaci. Aplikace na glykanovém profilu cetuximabu ukázala rychlé přiřazení přibližně 20 jednotlivých N-glykanů.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy bez nutnosti nákladných exoglykozidázových digescí nebo MSn experimentů.
• Kompatibilita s libovolným LC systémem využívajícím HILIC AdvanceBio kolonu.
• Volně dostupná webová aplikace zvyšuje reprodukovatelnost a usnadňuje rutinní QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření knihovny o další deriváty a méně běžné glykany.
• Integrace strojového učení pro pokročilejší predikci retenčních časů.
• Automatizace workflow a napojení na LIMS systémy pro průmyslové nasazení.

Závěr

GU-normalizovaná knihovna a Glycan Peak Assignment Tool představují efektivní a přesný nástroj pro predikci retenčních časů N-glykanů, zrychlují rutinní analýzy a umožňují spolehlivé spojení FLD a MS dat.

Reference

1. Zhou Q a Qui H The mechanistic impact of N-glycosylation on stability pharmacokinetics and immunogenicity of therapeutic proteins Journal of Pharmaceutical Sciences 2019 108 13666–1377
2. Guile GR et al A rapid high-resolution high-performance liquid chromatographic method for separating glycan mixtures and analyzing oligosaccharide profiles Analytical Biochemistry 1996 240 210–226
3. Gautam S et al Glucose unit index GUI of permethylated glycans for effective identification of glycans and glycan isomers Analyst 2020 145 6656–6667
4. Robinson R et al Improved Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography for LC/FLD/MS Analysis of Released N-Glycans Agilent Technologies Application Note 5994-6916EN 2023