High-Throughput Human Serum and Immunoglobulin G N-Glycome Profiling with the Agilent AdvanceBio Gly-X InstantPC Technology for Biomarker Discovery

Význam tématu

Proteinová glykosylace ovlivňuje klíčové biologické procesy a její změny se pojí s řadou onemocnění. Kvantitativní profilování N-glykánů v lidském séru a IgG poskytuje hodnotné biomarkery pro diagnostiku a sledování patologických stavů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo představit rychlý a citlivý postup přípravy a analýzy N-glykánů z lidského séra a izolovaného IgG pomocí Agilent AdvanceBio Gly-X InstantPC technologie. Studie demonstruje workflow, které umožňuje kompletní přípravu vzorku a chromatografické rozdělení během přibližně jediné hodiny s vysokou reprodukovatelností.

Použitá metodika

• Deglykosylace: in-solution enzymatické odstranění N-glykánů z 1 μL séra nebo 40 μg IgG v 96-jamkové destičce, 90 °C/3 min a 50 °C/5 min.
• Derivatizace: okamžité značení uvolněných glykozylaminů fluorescenčním činidlem InstantPC (50 °C/1 min).
• Čištění: odfiltrování nadbytečných reagentů na Gly-X InstantPC clean-up destičce s formickou kyselinou a acetonitrilem.
• Chromatografie: HILIC/FLD separace na Agilent 1260 Infinity II LC systému se sloupcem AdvanceBio Glycan Mapping (2.1×150 mm, 2.7 μm), gradient 27–62 % acetonitrilu, detekce vzrušením 285 nm a emisí 345 nm.

Použitá instrumentace

• Agilent AdvanceBio Gly-X N-glycan prep with InstantPC kit, 96 ct (GX96-IPC).
• Agilent 1260 Infinity II LC system s AdvanceBio Glycan Mapping column (120 Å, 2.1×150 mm, 2.7 μm).
• Autosampler, quaternární čerpadlo a fluorescence detektor (FLD).

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza InstantPC značených N-glykánů IgG prokázala přítomnost až 14 hlavních forem s převahou fukosylovaných a galaktosylovaných struktur (např. FA2G1 24,9 %, FA2 18,4 %, FA2G2 13,0 %). Séra obsahovala dominantně disialylované glykany (A2G2S2 41,9 %) doplněné o tri- a monosialylované formy. Rozlišené chromatografické špičky byly dobře separované a metodika vykazovala vysokou citlivost a reprodukovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Extrémně rychlá příprava vzorku (< 10 min) vhodná pro vysokopropustné analýzy.
• Vysoká citlivost umožňuje práci s minimálními objemy vzorku (1 μL séra, 40 μg IgG).
• Automatizovatelné 96-jamkové formáty zkracují dobu a snižují variabilitu.
• Komplexní profilování N-glykánů podporuje objevování biomarkerů pro diagnostiku onemocnění.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní strukturní analýzu.
• Rozšíření aplikací na další glykoproteiny a matricové vzorky.
• Vývoj nových fluorescenčních značek pro lepší detekční limity.
• Implementace v klinické praxi pro personalizovanou medicínu a monitorování terapie.

Závěr

Agilent AdvanceBio Gly-X InstantPC technologie představuje efektivní a citlivý nástroj pro profilování N-glykánů z lidského séra a IgG. Rychlý workflow, minimální spotřeba vzorku a vysoká reprodukovatelnost podpoří rozvoj glykomických studií a objevování nových diagnostických biomarkerů.

Reference

1. Reily C. a kol. Glycosylation in Health and Disease. Nat. Rev. Nephrol. 2019;15:346–366.
2. Ohtsubo K., Marth J.D. Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease. Cell 2006;126:855–867.
3. Varki A. Essentials of Glycobiology. 2015.
4. Clerc F. a kol. Human Plasma Protein N-glycosylation. Glycoconj. J. 2016;33:309–343.
5. Anderson N.L., Anderson N.G. The Human Plasma Proteome. Mol. Cell Proteomics 2002;1:845–867.
6. Arnold J.N. a kol. The Impact of Glycosylation on the Biological Function and Structure of Human Immunoglobulins. Annu. Rev. Immunol. 2007;25:21–50.
7. Gudelj I., Lauc G., Pezer M. Immunoglobulin G Glycosylation in Aging and Diseases. Cell Immunol. 2018;333:65–79.
8. Quast I. a kol. Sialylation of IgG Fc Domain Impairs Complement-Dependent Cytotoxicity. J. Clin. Invest. 2015;125:4160–4169.
9. Zhong A. a kol. Diagnostic Significance of Serum IgG Galactosylation in CA19-9-Negative Pancreatic Carcinoma Patients. Front. Oncol. 2019;9:114.
10. Melmer M. a kol. HILIC Analysis of Fluorescence-Labeled N-Glycans from Recombinant Biopharmaceuticals. Anal. Bioanal. Chem. 2010;398:905–914.
11. Ruhaak L.R. a kol. Glycan Labeling Strategies and Their Use in Identification and Quantification. Anal. Bioanal. Chem. 2010;397:3457–3481.
12. Xie Y. a kol. High-Throughput and High-Sensitivity N-Glycan Profiling. Anal. Biochem. 2021;623:114205.