Glycan Peak Assignment Tool (GPAT)

Význam tématu

Glykanová analýza je klíčovou součástí charakterizace terapeutických proteinů, protože ovlivňuje jejich účinnost, stabilitu a imunogenicitu. Metoda HILIC/FLD nabízí robustní přístup k oddělení a detekci N-glykanů, ale samotný retenční čas často nestačí pro jednoznačnou identifikaci strukturních izomerů. Normalizace na glukózové jednotky (GU) pomáhá překlenout variabilitu chromatografického systému, avšak vyžaduje rozsáhlé databáze a složitou kalibraci.

Cíle a přehled studie

Cílem práce je představit webový nástroj Glycan Peak Assignment Tool (GPAT), který využívá knihovny GU hodnot pro více než 100 InstantPC- a 2-AB značených N-glykanů. GPAT umožňuje automatizované přiřazení chromatografických píků na základě zadaných retenčních časů z maltodextrinového nebo glukózového žebříku, a to bez nutnosti sdílet citlivé vzorkové údaje.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Uvolněné a markované N-glykany z cetuximabu a standardních sad InstantPC a 2-AB.

• Chromatografie: Agilent AdvanceBio Amide HILIC kolona 2.1×150 mm, 1.8 µm, 60 °C
• Mobilní fáze: (A) 50 mM amonný formiát pH 4.4, (B) acetonitril
• Gradienty: Čtyři profily pro vzorky obsahující glycany neutrální až s S4 modifikací
• Detekce: fluorescence, λEx/λEm 285/345 nm pro InstantPC, 260/430 nm pro 2-AB
• Zařízení: Agilent 1290 Infinity II LC s Bio multisamplerem a multikolonovou termostatací, Agilent 1260 FLD
• Software: OpenLab CDS 2.7 pro integraci, GPAT pro predikci retenčních časů

Hlavní výsledky a diskuse

GPAT predikoval retenční časy glykanů s průměrnou chybou pod 2 % a po použití volitelné refinment funkce pod 1 %. V cetuximabovém vzorku bylo identifikováno 13 glykanů v InstantPC a 9 v 2-AB chromatogramech. Refinment na základě dvou standardních glykanů (jeden neutrální, jeden kyselý) významně zvýšil přesnost, zejména pro pozdně eluované sloučeniny s dvěma až čtyřmi sialovými zbytky. Příklady oken tolerovaných RT pro pík Man5 versus FA2G1[3]S(3)1 ukazují, že pro většinu piků lze vyselektovat úzkou skupinu kandidátů.

Přínosy a praktické využití metody

GPAT zrychluje a zjednodušuje workflow stanovení glykového profilu, eliminuje potřebu ručních porovnání s literárními daty a minimalizuje sdílení citlivých informací o vzorku. Nástroj je volně přístupný, kompatibilní se standardními HILIC/FLD systémy a usnadňuje QA/QC v biotechnologických laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření databáze o nové typy značek, integrace detekce hmotnostním spektrometrem a využití strojového učení pro adaptivní kalibraci mohou ještě zvýšit univerzálnost a přesnost predikcí. Automatizace vstupu dat a cloudové řešení GPAT umožní širší sdílení a kolaborativní aktualizace knihovny.

Závěr

Glycan Peak Assignment Tool představuje efektivní řešení pro přiřazování chromatografických píků N-glykanů s minimalizovanou chybou predikce. Díky použití GU knihoven a možnosti refinment nabízí vysokou míru automatizace, kterou ocení jak výzkumné, tak rutinní QA/QC laboratoře.

Reference

1. Zhou Q, Qui H. The mechanistic impact of N-glycosylation on stability, pharmacokinetics, and immunogenicity of therapeutic proteins. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2019;108(5):1366–1377.
2. Delobel A. Glycosylation of therapeutic proteins: a critical quality attribute. In: Mass Spectrometry of Glycoproteins: Methods and Protocols. Springer US; 2021:1–21.
3. Guile GR, Rudd PM, Wing DR, Prime SB, Dwek RA. A rapid high-resolution HPLC method for separating glycan mixtures and analyzing oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 1996;240:210–226.
4. Zapun A, Petrescu SM, Rudd PM, Dwek RA, Thomas DY, Bergeron JJM. Conformation-independent binding of monoglucosylated ribonuclease B to calnexin. Cell. 1997;88:29–38.
5. Campbell MP, Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA, Rudd PM. GlycoBase and autoGU: Tools for HPLC-based glycan analysis. Bioinformatics. 2008;24:1214–1216.
6. Robinson R, et al. Improved hydrophilic interaction liquid chromatography for LC/FLD/MS analysis of released N-glycans. Agilent Technologies application note. 2023.