Systematic Evaluation of Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography Stationary Phases for Oligonucleotide Characterization by LC/MS

Význam tématu

Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) se ukazuje jako perspektivní alternativa k tradičním metodám IP-RPLC a IEX pro analýzu oligonukleotidů. Nabízí mobilní fáze kompatibilní s hmotnostní spektrometrií a eliminuje nutnost používání iontově párovacích činidel, což zjednodušuje instrumentaci a zvyšuje flexibilitu analytických postupů.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo systematicky porovnat pěti různých HILIC stacionárních fází z hlediska klíčových interakcí (hydrofobita, hydrofilita, sterické účinky, vodíkové vazby, iontová výměna a kyselost/bázovost) pomocí Tanaka testu a následně ověřit jejich výkon při LC/MS separaci DNA, RNA a modifikovaných antisense oligonukleotidů.

Použitá metodika

Byla využita kombinace dvou přístupů:

• Tanaka test – stanovení retenčních selektivit pěti HILIC fází na párech standardních analytů (uridin vs. 5-methyluridin) za různých podmínek pH.
• HILIC-LC/MS separace – optimalizované gradienty a pH mobilní fáze (4,4; 6,8; 9,0) pro rozlišení 15–40 mer DNA a RNA standardů a modifikovaných antisense oligonukleotidů (ASO).

Použitá instrumentace

Agilent Technologies:

• Kolony 2,1×150 mm: InfinityLab Poroshell 120 HILIC, HILIC-OH5, HILIC-Z; AdvanceBio Glycan Mapping; AdvanceBio Amide HILIC.
• LC systémy: 1260 Infinity Bioinert Quat Pump, 1260 Infinity Diode Array Detector, 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment.
• MS detektor: 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF.
• Mobilní fáze: 100 mM amonný acetát v pH 4,4 nebo 9,0; směsi vody a acetonitrilu (10 % pufr/90 % organika nebo voda).

Hlavní výsledky a diskuse

• Tanaka test ukázal odlišné profily interakcí: některé fáze vynikaly hydrofilitou, jiné iontovou výměnou nebo vodíkovými vazbami (viz radarové diagramy).
• Optimální separace DNA a RNA (15–40 mer) byla dosažena při pH 6,8 a 9,0 s posunem retenčních časů a zlepšením rozlišení vyšším pH.
• Při pH 9,0 se zvýšila četnost sodných a draselných aduktů, což vyžaduje pečlivou optimalizaci zdrojových podmínek MS.
• Modifikované ASO analyzované na HILIC-Z kolóně vykázaly výrazné zlepšení tvaru a symetrie špiček zvýšením teploty kolony z 30 °C na 60 °C.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda HILIC-LC/MS umožňuje rychlé a citlivé charakterizování oligonukleotidů bez potřeby iontově párovacích činidel. Lze ji aplikovat v QA/QC biotechnologických a farmaceutických laboratořích pro analýzu délkových variant a chemických modifikací sekvencí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dálková optimalizace pH a pufrovací soustavy pro minimalizaci kovových aduktů a zlepšení citlivosti MS.
• Vývoj nových HILIC stacionárních fází se zaměřením na cílené interakce s modifikovanými nukleotidy.
• Integrace vysokopropustného screeningu a automatizovaných pracovních postupů pro výzkum oligonukleotidových terapeutik.

Závěr

HILIC se osvědčil jako efektivní a flexibilní metoda pro LC/MS analýzu oligonukleotidů. Klíčovými parametry jsou volba stacionární fáze, pH mobilní fáze a teplota kolony, které výrazně ovlivňují rozlišení a kvalitu spekter.

Reference

1. Buszewski B. a Noga S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) – a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402(1):231–247, 2012.
2. Kawachi Y. et al. Chromatographic characterization of hydrophilic interaction liquid chromatography stationary phases: Hydrophilicity, charge effects, structural selectivity, and separation efficiency. J Chromatogr A. 1218:5903–5919, 2011.
3. Lardeux H., Guillarme D., D’Atri V.D. Comprehensive evaluation of zwitterionic hydrophilic liquid chromatography stationary phases for oligonucleotide characterization. J Chromatogr A. 1690:463785, 2023.