Emerging Alternative Analytical Techniques for Oligonucleotide Separation and Purification: HILIC & SEC

Význam tématu

Oligonukleotidy představují rostoucí třídu terapeutik a analytika jejich čistoty, sekvenční integrity i agregace je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti. Tradiční techniky, jako IP-RP a IEX, mají omezení v kompatibilitě s LC-MS a instrumentálním vybavením. HILIC a SEC nabízejí atraktivní alternativu díky lepší kompatibilitě s MS, flexibilitě při výměně mobilních fází a spolehlivé analýze vyšších struktur.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo prozkoumat uplatnění HILIC a SEC jako náhradních metod pro separaci a purifikaci oligonukleotidů. Práce se zaměřila na:

• Vyhodnocení různých HILIC fází pomocí Tanaka testu
• Optimalizaci separace DNA a RNA oligo standardů při rozdílném pH
• Charakterizaci kolony AdvanceBio SEC 1000 Å pro detekci agregátů a vyšších struktur
• Srovnání mobilních fází a jejich vlivu na rozlišení

Použitá metodika a instrumentace

• HILIC chromatografie: InfinityLab Poroshell 120 HILIC, HILIC-OH5, HILIC-Z, AdvanceBio Glycan Mapping, AdvanceBio Amide HILIC (2.1×150 mm)
• Mobilní fáze pro HILIC: 10 % 100 mM amoniakálně octanové pufry (pH 4.4 nebo 9.0) / 90 % vody nebo acetonitrilu
• SEC chromatografie: AdvanceBio SEC 1000 Å, 2.7 µm, 7.8×300 mm (PL1180-5302)
• Mobilní fáze pro SEC: 100 mM trismocetát + 2.5 mM EDTA nebo 150 mM fosfátový pufr, pH 7.0
• Podmínky: průtok 0.6 mL/min, teplota kolony 40 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Studie HILIC odhalila, že rozlišovací schopnost závisí na chemických vlastnostech stacionární fáze. Tanaka test ukázal klíčové interakce (hydrofobní, hydrofilní, iontové, vodíkové vazby). Fáze HILIC-Z prokázala stabilitu při vyšším pH a efektivní separaci DNA a RNA standardů s výrazným posunem retenčních časů.

Ve variantách pH 4.4 vs. 6.8 bylo možné upravit gradient a dosáhnout lepší špičatosti a rozlišení. Při pH 9.0 se ukázaly specifické změny ve vazebných mechanismech, což je důležité pro LC-MS analýzu.

V oblasti SEC přinesla kolona AdvanceBio SEC 1000 Å vysoké rozlišení pro dlouhé oligoribonukleotidy (mRNA ~2000–3700 nt). Potvrdila se nutnost větších pórů pro správné stanovení agregátů, kdy poly dT oligo odpovídalo globulárnímu proteinu 50–60 kDa. Různé mobilní fáze ukázaly vliv na špičatost, přičemž fosfátový pufr vykazoval nižší tailing než trismocetát.

Přínosy a praktické využití metody

• HILIC:
  
  • Kompatibilita s LC-MS bez potřeby ion-pair činidel
  • Možnost sdílených přístrojů pro různé workflow
  • Efektivní separace dle polarity a struktury oligonukleotidů
• SEC:
  
  • Monitorování agregace a vyšších struktur oligo/mRNA
  • Jednoduchá příprava a rychlá analýza velikostních variant
  • Optimalizace pro dlouhé terapeutické sekvence

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj specializovaných HILIC materiálů se zaměřením na stabilitu při širokém pH rozmezí a lepší selektivitu pro modifikované nukleotidy. V SEC lze očekávat posun k monolitickým kolonám a novým povrchovým úpravám pro precizní kontrolu separačního řádu. Kombinace HILIC-SEC-MS bude klíčová pro komplexní charakterizaci terapeutických oligonukleotidů.

Závěr

HILIC a SEC představují perspektivní alternativy ke konvenčním IP-RP a IEX metodám v analytice oligonukleotidů. Umožňují kompatibilní workflow s MS, flexibilitu instrumentace a efektivní stanovení agregátů. Implementace těchto technik podpoří vysoce kvalitní charakterizaci nových oligo-terapeutik.