TIDES: ANALYSIS OF mRNA CRITICAL QUALITY ATTRIBUTES (CQAs) USING THE BIOACCORD UPLC-TOF MS SYSTEM AND INTACT Mass SOFTWARE

Význam tématu

mRNA terapie a vakcíny na bázi mRNA, jak například vakcíny proti COVID-19, ukázaly obrovský potenciál RNA-léčiv v biotechnologiích. Pro zajištění kvality a bezpečnosti při výrobě těchto léčiv je nezbytné rychle a přesně charakterizovat jejich kritické kvality atributy (CQAs), mezi které patří účinnost 5' kapování, heterogenita poly(A) ocasu a věrnost sekvence.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat analytickou strategii pro tři hlavní CQAs mRNA: 5' kapování, heterogenitu poly(A) ocasu a mapování sekvence. Využili jsme přístroj BioAccord UPLC-TOF MS v kombinaci s pokročilým softwarem INTACT Mass App pro rychlou a spolehlivou charakterizaci mRNA vzorků různého složení.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická metoda zahrnovala:

• Chromatografii: Ion-pair reverzní fázová UPLC na kolóně ACQUITY Premier OST 1,7 µm, 130 Å, 2,1 × 150 mm.
• Detekci: UV detektor a TOF hmotnostní spektrometr s vysokým rozlišením.
• Přípravu vzorku: RNase T1 štěpení mRNA pro analýzu poly(A) ocasu a mapování sekvence; syntetické oligoribonukleotidy pro test 5' kapování.
• Software: INTACT Mass App s nástroji Enzyme Cleavage Tool a Sequence Mapping Viewer pro dekonvoluci hmotnostních dat, určení průměrné délky poly(A) ocasu a výpočet pokrytí sekvence.

Hlavní výsledky a diskuse

Poly(A) ocas: Rychlé chromatografické rozlišení heterogenních poli(A) fragmentů umožnilo zpracovat hmotnostní spektra a vypočítat vážený průměr délky ocasu cca 126,5 nukleotidů.
5' kapování: Pomocí syntetického Cap-1 oligoribonukleotidu smíchaného s nekanonickými prekurzory v poměrech 99:1, 9:1 a 1:1 bylo možné stanovit relativní množství správně kapovaných molekul.
Mapování sekvence: RNase T1 šetrně štěpí mRNA na definované fragmenty, které byly analyzovány LC-MS/MS. Software zvýraznil pokrytí až 100mer sgRNA a cca 4000mer luciferázové mRNA, včetně rozlišení izobarických sekvencí.

Přínosy a praktické využití metody

Integrované řešení BioAccord UPLC-TOF MS se softwarem INTACT Mass App umožňuje:

• Rychlou a robustní analýzu tří klíčových CQAs na jediné platformě.
• Minimalizaci manuálního zásahu díky automatizovaným nástrojům pro dekonvoluci a mapování.
• Vysokou citlivost a přesnost pro QC laboratoře v biopharma průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se zaměří na:

• Integraci dat z MS1 a MS2 pro zvýšení pokrytí sekvence.
• Úplnou automatizaci zpracování dat s cílem snížit nejednoznačné přiřazení fragmentů.
• Rozšíření analytiky na další RNA formy a modifikace.

Závěr

Navržený analytický workflow spojující BioAccord UPLC-TOF MS a INTACT Mass App efektivně řeší charakterizaci tří kritických atributů mRNA. Metoda nabízí vysokou citlivost, přesnost a automatizaci, což výrazně zkracuje dobu potřebnou pro vývoj a kontrolu kvality RNA léčiv.

Reference

1. Waters Application Note: 720008130 RNA CQA Analysis using the BioAccord LC-MS System and INTACT Mass waters_connect Application
2. Waters Application Note: 720007329 Rapid Analysis of Synthetic mRNA Cap Structure Using Ion-Pairing RPLC with the BioAccord LC-MS System
3. Waters Application Note: 720007925 Ion Pairing Reversed Phase LC-MS Analysis of Poly(A) Tail Heterogeneity Using the BioAccord LC-MS System