Coupling MALS with preparative ionic-exchange (pIEX) for structural biology applications

Význam tématu

Ion-exchange chromatografie (IEX) patří mezi základní kroky v protokolech purifikace proteinů pro strukturální biologie. Přidání multiúhlové světelné rozptylové detekce (MALS) přímo na preparativní IEX (pIEX-MALS) umožňuje okamžitě stanovit absolutní molární hmotnost eluovaných frakcí. Díky tomu lze rychle identifikovat čisté monomerní formy a optimalizovat poolování bez zbytečného času a materiálu.

Cíle a přehled studie

Cílem článku je demonstrovat využití pIEX-MALS při purifikaci Fab fragmentů monoklonálních protilátek pro krystalografii. Porovnána byla tradiční workflow založená na post-IEX analýze na SEC-MALS s novou metodou, kde je MALS integrován přímo na IEX. Studie ukazuje, že pIEX-MALS výrazně zkracuje čas a snižuje nároky na materiál i práci.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda:pIEX na Mono S kationtové výměnné koloně (30 mM acetát, pH 5,5) s gradientem 0–250 mM NaCl během 20 kolonnových objemů. Detekce:

• UV 280 nm (FPLC ÄKTA pure)
• multiúhlová rozptylová detekce (miniDAWN MALS)
• diferenční refraktometrie (Optilab dRI, dn/dc = 0,185 mL/g)

Software: ASTRA pro akvizici, analýzu signálů a případnou baseline subtrakci.

Hlavní výsledky a diskuse

Fab1: Eluce začíná již při minimální koncentraci soli, což ztěžuje stanovení baseliny v RI. MALS v kombinaci s UV umožnilo jednoznačně vymezit čisté frakce (27,5–29 mL) a vyřadit zastiňující nízkomolekulární a vysocemolekulární příměsi. Fab2: Eluce ve střední části gradientu poskytla dobře definovanou špičku o hmotnosti 50,2 kDa. Pomocí MALS+RI byl potvrzen monomerní charakter a vysoká čistota celé špičky (22–26 mL). Pros a kontra: pIEX-MALS čelí šumu ze změn gradientu a částic, ale vysoké koncentrace v preparativním režimu tyto vlivy potlačují. Baseline subtrakce v ASTRA ještě zvyšuje přesnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Okamžitá identifikace čistých frakcí během preparativní IEX
• Eliminace potřeby předběžných SEC-MALS analýz po IEX
• Snížení spotřeby bufferů, vzorku a laboratorního času
• Zrychlení přípravy materiálu pro krystalizaci a další strukturální studie

Budoucí trendy a možnosti využití

• Implementace vysokokoncentrační dRI detekce pro ještě širší rozsahy gradientů soli
• Aplikace pIEX-MALS na další chromatografické režimy (aniontová výměna, hydrofobní interakce)
• Integrace s automatizovanými platformami pro paralelní screening purifikací
• Využití pokročilých algoritmů pro online zpracování dat a predikci stability proteinů

Závěr

Preparativní IEX spojená s MALS detekcí představuje efektivní a spolehlivou metodu pro rychlou purifikaci monomerních proteinů ve vysoké kvalitě. pIEX-MALS umožňuje bezprostřední rozhodnutí o poolování frakcí a významně zkracuje čas i náklady potřebné k získání materiálu pro strukturální biologie.

Reference

• Amartely H., Avraham O., Friedler A., Livnah O., Lebendiker M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Sci Rep 8, 6907 (2018).