Aggregate Analysis of mRNA Using the Agilent Infinity II Bio LC System and Bio-SEC Columns

Význam tématu

mRNA se díky své schopnosti nést genetickou informaci stala klíčovým nosičem v oblasti vakcín a nových bioterapeutik. Monitorování agregace mRNA je zásadní, protože oligomerizace nebo špatné strukturální uspořádání může snižovat translaci do proteinů, ovlivňovat stabilitu i efektivitu vstřikování v lipidových nanočásticích a představovat riziko při výrobě a skladování vakcín.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl porovnat vliv výběru kolony a mobilní fáze na analýzu agregátů mRNA pomocí systému Agilent Infinity II Bio LC v souladu s návrhem analytických postupů USP pro kvalitu mRNA vakcín. Testované podmínky zahrnují tři různé pórové velikosti SEC-5 kolon a dvě běžné pufrovací soustavy.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrahigh–performance SEC analýzu prováděl Agilent 1290 Infinity II Bio LC systém se železně inertními cestami. Použité moduly:

• Bio vysokorychlostní pumpa
• Bio multisampler s termostatem
• Multikolonní termostat s bio-inertním výměníkem
• Diodový array detektor s bio-inertní kuvlétou

Kolony:

• Bio SEC-5 500 Å
• Bio SEC-5 1000 Å
• Bio SEC-5 2000 Å

Mobilní fáze:

• 150 mM fosfátový pufr pH 7,0
• 100 mM tris-acetát + 2,5 mM EDTA

Odběrové standardy:

• DNA ladder 100 bp a 1 kbp
• Poly(A) prvek
• CleanCap mRNA vzorky

Software pro zpracování dat: Agilent OpenLab CDS verze 2.7.

Hlavní výsledky a diskuse

Volba pórové velikosti kolony přímo ovlivňuje rozlišení fragmentů:

• 500 Å vhodná pro analýzu mRNA menší než 300 bp
• 1000 Å pro velikosti do 1000 bp
• 2000 Å pro fragmenty okolo 2000 bp a větší

Srovnání pufrů ukázalo, že Tris-acetát/EDTA zkracuje dobu elučního průchodu a mírně zvyšuje odhadovanou molekulovou hmotnost. Analýza CleanCap FLuc mRNA (~1930 nt) na 1000 Å kolóně s Tris-EDTA pufrem detekovala asi 8,5 % agregátů, kdežto u 2000 Å došlo ke sníženému rozlišení. Studii β-galactosidáza mRNA (~3420 nt) prokázala vyšší podíl agregátů (přibližně 24,9 %) na 1000 Å, ale optimální separaci pro oba testované zákaznické vzorky nabízela 2000 Å kolóna (12,7 % a 9,6 % agregátů).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a reprodukovatelnou kvantifikaci agregátů mRNA pro kontrolu kvality při vývoji a výrobě vakcín. Navrhuje jasná kritéria pro výběr SEC-5 kolony dle velikosti analyzované mRNA, čímž usnadňuje zavedení v rutiních QA/QC laboratořích. Bio-inertní cestou se eliminuje riziko interakcí s kovovými částmi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Výhledově lze očekávat:

• Vývoj kolonn se specifickým chemickým povrchem pro ještě ostřejší separaci
• Optimalizaci pufrovacích systémů pro dlouhodobou stabilitu mRNA
• Integraci s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci agregátů
• Rozšíření postupu na nové typy RNA terapeutik

Závěr

Pro přesné stanovení agregace mRNA je klíčový výběr vhodné SEC kolony ve vazbě na délku RNA a použité pufrové složení. Sistém Agilent Infinity II Bio LC nabízí flexibilitu a inertní cestu, která minimalizuje artefakty a zajišťuje konzistentní výsledky v souladu s USP doporučeními.

Reference

• USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality Draft Guidelines 2nd Edition 2023
• Park C et al. Differential Requirements for mRNA Folding ... PNAS 2013 110(8) E678–E686
• Borodavka A et al. Sizes of Long RNA Molecules ... Biophys J 2016 111(10) 2077–2085
• Cheng F et al. Research Advances on the Stability of mRNA Vaccines. Viruses 2023 15(3) 668