SEC for Ultra-Large Analytes

Význam tématu

Size Exclusion Chromatography (SEC) představuje základní nástroj pro separaci biomolekul podle velikosti v roztoku. S rostoucí poptávkou po pokročilých bioterapeutikách, jako jsou monoklonální protilátky, konjugáty protilátka-lék, virové vektory či dlouhé nukleové kyseliny, je přesná charakterizace ultra-velkých analyzátů klíčová pro zajištění kvality, stability a bezpečnosti léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

• Poskytnout přehled portfolio SEC kolonek vhodných pro rozsah od malých peptidů až po virové částice a mRNA.
• Vymezit kritéria výběru porézní velikosti a velikosti částic pro optimální rozlišení.
• Představit metodické postupy a parametry (flow rate, délka kolony, detektory) pro vysokou reprodukovatelnost a citlivost.
• Porovnat výkonnost různých sloupců na modelech AAV, VLP, DNA/RNA stanadardů a monoklonálních protilátek.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika je založena na separaci biomolekul v náplních s řízenou porézností. Hlavní parametry:

• Porézní velikost: 120–2000 Å podle typu analyzátu (peptidy, proteiny, viry, nukleové kyseliny).
• Velikost částic: 1,9–5 µm pro optimalizaci rozlišení versus tlak.
• Délka kolony: 150–300 mm pro vyvážení mezi kapacitou a dobou analýzy.
• Průtok: 0,175–1,0 mL/min; nižší rychlosti zlepšují difúzi velkých molekul a rozlišení.

Použitá instrumentace

• Sloupce AdvanceBio SEC (120–1000 Å, 1,9 a 2,7 µm), Bio SEC-5 (2000 Å, 5 µm), PROTEEMA Lux (1000 Å, 5 µm).
• HPLC/UPLC systémy kompatibilní s nízkým únikem (low-bleed) pro UV, fluorescenční (FLD) a MALS detekci.
• Detektory: UV/Vis, fluorescenční detektory pro nízké koncentrace virových částic a MALS pro stanovení molární hmotnosti a hydrodynamického poloměru.
• Mobilní fáze: fosfátové nebo PBS pufry s trojitou filtrací, eventuálně s přídavkem NaCl pro stabilizaci virových vektorů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimální rozlišení pro malé proteiny (1–100 kDa) poskytují sloupce s porézností 120–300 Å a částicemi 1,9–2,7 µm.
• Pro středně velké biomolekuly (100–500 kDa, mAbs, ADC) se ukázaly nejvhodnější sloupce 300–500 Å, 2,7 µm.
• Ultra-velké analyzáty (AAV, VLP, DNA/RNA přes 1 MDa) vyžadují poréznost 1000–2000 Å a nižší průtoky (0,175–0,35 mL/min).
• Porovnání s konkurenčními kolonkami ukázalo lepší rozlišení (Rs až 3,2) a nižší sekundární interakce u sloupců AdvanceBio SEC.
• Nižší průtoky významně zlepšují difuzní výměnu a redukují šíření pásů u velkých molekul.
• Detektorové konfigurace (UV vs. FLD vs. MALS) ovlivňují citlivost a minimální detekovatelné množství analyzátu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a reprodukovatelná QC analýza agregátů a fragmentů bioterapeutik.
• Stanovení molární hmotnosti, polydisperzity a podílu prázdných/nabitých virových kapsid.
• Charakterizace DNA/RNA surovin a finalizovaných produktů pro genovou terapii.
• Optimalizace výrobních procesů a stability finálních formulací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace SEC s pokročilou detekcí (MALS, DLS, refraktivní index) pro komplexní charakterizaci.
• Vývoj monolitních a nanovlákenných materiálů pro vyšší propustnost a nižší tlak.
• Miniaturizace a vysokopropustné formáty pro screeningové aplikace.
• Automatizované platformy propojené s MS a multi-detekčními systémy.

Závěr

Studie demonstruje, že cílený výběr porézní velikosti, velikosti částic a provozních parametrů SEC kolony umožňuje spolehlivou analýzu širokého spektra bioterapeutik od malých peptidů až po virové vektory a nukleové kyseliny. Dodržování best-practice včetně použití vhodných standardů zajišťuje dlouhodobou stabilitu metody a vysokou kvalitu dat.

Reference

• Application Note 5994-7934EN: Calibration of Large Pore SEC Columns
• Application Note 5994-7509EN: AAV Serotype Separation
• Application Note 5994-7918EN: High-Resolution VLP Analysis
• Application Note 5994-8198EN: SEC of DNA and RNA Standards
• Application Note 5994-7745EN: SEC-MALS Analysis of mRNA