Choosing Appropriate Pore Size Columns for Size Exclusion Chromatography of Oligonucleotides

Význam tématu

Analytická chromatografie vyměšováním velikosti (SEC) je klíčovou metodou pro rozlišení oligonukleotidů na základě jejich hydrodynamického poloměru. V biotechnologické a farmaceutické praxi je čím dál důležitější přesná separace krátkých a dlouhých sekvencí DNA i RNA, a to pro charakterizaci léčiv, kontrolu kvality a výzkum mRNA vakcín.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo ukázat, jak vybrat vhodné SEC kolony s ohledem na velikost pórů pro separaci oligonukleotidů. Pomocí značkovaných DNA a RNA žebříčků autoři porovnali chromatografické vlastnosti tří SEC kolon, optimalizovali pracovní podmínky a vyhodnotili vliv průtoku a pufrování na kvalitu separace.

Použitá metodika a instrumentace

Všechny experimenty proběhly na Agilent 1260 Infinity II bio-inert LC systému s OpenLab CDS.

Reagencie a příprava vzorků:

• DNA Ladder (50 bp až 3 000 bp) a 1 kb DNA Ladder (Merck Sigma-Aldrich)
• RiboRuler HR RNA Ladder (Thermo Fisher) ředěný 1:10
• Mobilní fáze: 150 mM Na-fosfát pH 7,0; 2× PBS (20 mM fosfát + 280 mM NaCl) pH 7,4; 50 mM K-fosfát + 200 mM KCl pH 7,0

Testované kolony:

• AdvanceBio SEC 500 Å, 4,6×300 mm, 2,7 µm
• AdvanceBio SEC 1000 Å, 4,6×300 mm, 2,7 µm
• Waters GTxResolve Premier SEC 1000 Å, 4,6×300 mm, 3 µm

Parametry HPLC:

• Teplota: 30 °C
• Průtok: 0,175 a 0,35 mL/min
• Objem injekce: 5 µL
• Detekce: UV při 260 nm

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace průtoku ukázala, že snížení z 0,35 na 0,175 mL/min vede k vyššímu signálu u malých i velkých fragmentů díky delšímu pobytu v detektoru, aniž by utrpěla rozlišovací schopnost. Mobilní fáze s celkovou koncentrací soli 150–300 mM poskytla srovnatelnou retenci a tvary píků. Kalibrační křivky potvrdily lineární vztah mezi velikostí a retenční dobou pro jednotlivé kolony. Porovnání DNA a RNA žebříčků odhalilo, že jednovláknové RNA fragmenty díky flexibilnějším konformacím prostupují póry odlišně a elují později než dvouvláknové DNA o stejné délce.

Objem póru od vyloučení po permeaci byl u 1000 Å kolon asi o 20 % větší než u 500 Å, což rozšiřuje použitelné rozmezí fragmentů. Dualita mezi konformacemi DNA a RNA zdůrazňuje nutnost volit kolonu podle typu a délky analyzovaných nukleových kyselin.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a reprodukovatelná separace oligonukleotidů od 50 bp až po několik tisíc bp/nt
• Možnost volby mezi 500 Å a 1000 Å pro optimální rozsah rozlišení
• Aplikace v kontrole kvality bioterapeutik, vývoji siRNA, antisensových terapií a mRNA vakcín

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření kombinace SEC s multiúhlovým rozptylem světla (MALS) pro stanovení molekulové hmotnosti a agregace. Dalším krokem je vývoj kolon s mezistupněm pórovitosti pro jemnější rozlišení mezi velmi podobně velkými fragmenty. Zvýraznění denaturačních podmínek a zavedení chaotropních činidel v mobilní fázi umožní lepší separaci heterogenních a modifikovaných oligonukleotidů.

Závěr

Volba vhodné pore size kolony je klíčová pro robustní SEC separaci oligonukleotidů. Pro fragmenty do 500–1 000 bp je vhodná 500 Å kolona, pro rozsah do 2 000–3 000 bp se doporučuje 1000 Å. Optimalizace průtoku a složení mobilní fáze zajišťuje vysokou citlivost a reprodukovatelnost.

Reference

1. Schneider S., Rieck F. SEC-MALS for mRNA Characterization with the Agilent 1260 Infinity II Multi-Angle Light Scattering Detector, Agilent Technologies application note, publication number 5994-7745EN, 2024.