Determination of mRNA Encapsulation Efficiency with the Agilent 1290 Infinity II Bio LC System

Význam tématu

Encapsulace mRNA do lipidových nanovláken představuje klíčový krok při tvorbě moderních terapeutik založených na genetické informaci. Tento přístup zajišťuje ochranu mRNA proti degradaci, cílené dodání do buněk a zvýšení účinnosti léčiv, například vakcín a genových terapií. Přesná kvantifikace účinnosti inkapsulace je nepostradatelná pro kontrolu kvality, stabilitu produktu a reprodukovatelnost výrobního procesu.

Cíle a přehled studie

Cílem předkládané studie bylo vyvinout alternativní analytickou metodu k běžnému RiboGreen testu pro stanovení účinnosti inkapsulace F-luciferázové mRNA do lipidových nanovláken (LNP) pomocí iontově párové reverzní fáze HPLC (IP-RP-HPLC) na systému Agilent 1290 Infinity II Bio LC.

Použitá metodika

Příprava LNP se realizovala mikrofluidním mísením vodné fáze obsahující in vitro transkribovanou mRNA a organické fáze obsahující pět klíčových lipidů ve stanoveném molárním poměru. Extrakce mRNA z LNP proběhla izopropanolovou precipitací s následným 10násobným ředěním v amonném acetátu. Separace mRNA byla prováděna na koloni PLRP-S (2.1×150 mm, 8 µm) při 50 °C s plynulou gradientní elucí v prostředí TEAA/acetonitril. Detekce se prováděla diode array detektorem při 260 nm.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC system: vysokorychlostní pumpa G7132A, multisampler G7137A, multikolonový termostat G7116B, DAD G7117B
• Kolona Agilent PLRP-S, 2.1×150 mm, 8 µm, 4000 Å
• Agilent Cary 60 UV-Vis spektrofotometr (určení koncentrace mRNA)
• Benchtop mikrofluidní mísicí zařízení pro přípravu LNP
• Ultracentrifugační tuby s MWCO 30 kDa
• Solventy LC grade: acetonitril, isopropanol, methanol; TEAA; ultrapure voda z Milli-Q systému

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou linearitu v rozsahu 4.35–43.5 µg/mL (R² > 0.997). Intaktní F-luciferázová mRNA elutovala při 13.2 min, drobné fragmenty se oddělily kolem 10.6 min. Preciznost analýzy (n=6) vykázala RSD retenčního času < 1 % a RSD plochy < 10 %. Inkapsulační účinnost lyofilizovaných LNP s kryoprotektanty dosáhla 109.5 % (mannitol) a 108.1 % (trehalóza), bez kryoprotektantů 98.7 %, u nelyofilizovaných bez kryoprotektantů klesla na 69.4 %.

Přínosy a praktické využití metody

IP-RP-HPLC umožňuje selektivní rozlišení intaktní mRNA od fragmentů, čímž překonává omezení fluorescenčních metod. Metoda je vhodná pro robustní kontrolu kvality v procesu vývoje i výroby mRNA-LNP terapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace IP-RP-HPLC do výrobních linek s vyšší propustností, propojení s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci mRNA a automatizace extrakčních postupů. Dalším směrem je miniaturizace zařízení a vývoj online monitoringu stability LNP.

Závěr

Popsaná IP-RP-HPLC metoda na systému Agilent 1290 Infinity II Bio LC představuje citlivou, reprodukovatelnou a selektivní alternativu k RiboGreen testu pro stanovení účinnosti inkapsulace mRNA do LNP. Poskytuje klíčové parametry pro vývoj a kontrolu kvality mRNA-based terapeutik.

Reference

• Agilent Technologies Inc. Best Practices for Analysis of In Vitro Transcribed (IVT) mRNA Using the Agilent Fragment Analyzer Systems. Technical overview 5994-5927EN, 2023.
• Schober GB, Story S, Arya DP. A Careful Look at Lipid Nanoparticle Characterization: Analysis of Benchmark Formulations for Encapsulation of RNA Cargo Size Gradient. Sci Rep. 2024;14(1):2403.
• Maeki M, Uno S, Niwa A, Okada Y, Tokeshi M. Microfluidic Technologies and Devices for Lipid Nanoparticle-Based RNA Delivery. JCR. 2022;344:80-96.
• USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality. 2022.
• Carrasco MJ, Alishetty S, Alameh MG, et al. Ionization and Structural Properties of mRNA Lipid Nanoparticles Influence Expression in Intramuscular and Intravascular Administration. Commun Biol. 2021;4(1):956.
• Lokras A, Chakravarty A, Rades T, Christensen D, Franzyk H, Thakur A, Foged C. Simultaneous Quantification of Multiple RNA Cargos Co-Loaded into Nanoparticle-Based Delivery Systems. Int J Pharm. 2022;626:122171.
• Currie J, Dahlberg JR, Lundberg E, Eriksson J, Schweikart F, Nilsson GA, Oernskov E. Stability Indicating Ion-Pair Reversed-Phase Liquid Chromatography Method for Modified mRNA. JPBA. 2024;1(245):116144.
• Azarani A, Hecker KH. RNA Analysis by Ion-Pair Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography. Nucleic Acids Res. 2001;29(2):e7.
• Packer M, Gyawali D, Yerabolu R, Schariter J, White PA. A Novel Mechanism for the Loss of mRNA Activity in Lipid Nanoparticle Delivery Systems. Nat Commun. 2021;12(1):6777.