Characterization of Biomolecules using High-Performance UV-Vis Spectrophotometry

Význam tématu

Charakterizace biomolekul je zásadní pro pochopení biochemických procesů a vývoj moderních terapeutik. UV-Vis spektrofotometrie umožňuje rychlé a nedestruktivní stanovení koncentrace, kvality a stability oligonukleotidů a proteinů, což urychluje výzkum v oblasti genové terapie, diagnostiky i vývoje léků.

Cíle a přehled studie

Cílem přehledu je představit technické a praktické možnosti použití přístroje Agilent Cary 3500 UV-Vis pro šest klíčových aplikací v biomolekulární analytice: stabilitní studie, analýzu proteinové agregace, komparativní spektrální analýzy druhé derivace, termální melty, kvantifikaci a měření enzymové aktivity.

Použitá metodika a instrumentace

Pro měření se využívá spektrofotometr Agilent Cary 3500 UV-Vis v konfiguracích Multicell a Compact. Multicell modul nabízí osm kanálů se samostatnou Peltierovou regulací teploty (0–110 °C) a interní teplotní sondu pro rychlé rampy. Compact modul zajišťuje měření v jedné nebo dvou polohách při ambietní či řízené teplotě. Veškeré řízení a zpracování dat probíhá v softwaru Agilent Cary UV Workstation s možností 21 CFR Part 11 compliance.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie dokumentují:

• Stabilitní testy proteinů a nukleotidů za různých podmínek (teplota, pH, soli, denaturanty).
• Analýzu proteinové agregace sledováním rozptýleného světla při 350 nm.
• Komparativní spektroskopii se druhou derivací pro detekci jemných konformačních změn.
• Termální melty oligonukleotidů a proteinů s optimalizovanými rampami od 0,5 do 40 °C/min.
• Kvantifikaci nukleotidů (absorpce při 260 nm, poměry 260/280, 260/230) a proteinů inkluzí barviv jako Bradfordův test.
• Sledování kinetiky enzymových reakcí na jedné vlnové délce i v celém spektrálním rozsahu.

Přínosy a praktické využití metody

• Současné měření až osmi vzorků zrychluje laboratorní workflow.
• Vysoká přesnost a opakovatelnost díky Xenonové zábleskové lampě s dlouhou životností.
• Široké spektrum aplikací od základního výzkumu až po QA/QC v GMP prostředí.
• Možnost malých objemů (50 μl) ultra-mikrocuvet bez složité optické úpravy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj integrovaných automatizovaných řešení pro vysokopropustná měření, pokročilá data-miningová analýza spektrálních dat a kombinace UV-Vis s dalšími spektroskopickými technikami. Vyspělé softwarové nástroje pro umělou inteligenci mohou dále zrychlit interpretaci komplexních spektrogramů biomolekul.

Závěr

Agilent Cary 3500 UV-Vis poskytuje flexibilní a výkonnou platformu pro komplexní charakterizaci oligonukleotidů i proteinů. Díky simultánnímu měření, přesnému řízení teploty a robustnímu softwarovému prostředí je ideálním řešením pro akademické i průmyslové laboratoře zaměřené na molekulární biologii, diagnostiku a vývoj nových terapeutik.

Reference

1. Lundin KE, Gissberg O, Smith CL. Oligonucleotide Therapies: The Past and the Present. Hum Gene Ther. 2015;26(8):475–485.
2. Leader B, Baca Q, Golan D. Protein Therapeutics: A Summary and Pharmacological Classification. Nat Rev Drug Discov. 2008;7:21–39.
3. Lai LB et al. Structural Basis for Impaired 5’ Processing of a Mutant tRNA Associated with Defects in Neuronal Homeostasis. Proc Natl Acad Sci USA. 2022 Mar 8;119(10):e2119529119.
4. Yang L et al. Photoactivatable Circular Caged Oligonucleotides for Transcriptome In Vivo Analysis (TIVA). ChemPhotoChem. 2021;5(10):940–946.
5. Pan X et al. A Genetically Encoded Tool to Increase Cellular NADH/NAD+ Ratio in Living Cells. Nat Chem Biol. 2023 Oct 26.
6. Kline MC, Duewer DL. Evaluating Digital PCR for the Quantification of Human Nuclear DNA: Determining Target Strandedness. Anal Bioanal Chem. 2020;412(19):4749–4760.
7. Riley MB et al. Structure and Activity of Native and Thiolated Α-Chymotrypsin Adsorbed onto Gold Nanoparticles. Colloids Surf B Biointerfaces. 2022;220:112867.
8. Raymond-Smiedy P et al. A Spectrophotometric Turbidity Assay to Study Liquid-Liquid Phase Separation of UBQLN2 In Vitro. Methods Mol Biol. 2023;2551:515–541.