Characterization of Protein Thermal Stability Using UV-Vis Spectroscopy

Význam tématu

Studium termální stability proteinů je zásadní pro vývoj a formulaci bioterapeutik. Data o teplotní odolnosti poskytují vhled do struktury, skládání a agregace proteinů, což ovlivňuje jejich skladovatelnost, biologickou aktivitu a bezpečnost.

Cíle a přehled studie

Cílem přiložené studie bylo demonstrovat rychlou a přesnou charakterizaci termální stability enzymu Escherichia coli disulfid izomerázy A (EcDsbA) pomocí spektrofotometru Agilent Cary 3500 UV-Vis vybaveného Peltierově řízeným multicell modulem. Dále se ověřovala opakovatelnost měření a srovnání naměřených hodnot s literaturou.

Použitá metodika a instrumentace

Měření bylo provedeno ve dvou krocích:

• Spektrální sken: rozsah 200–400 nm, šířka pásma 2 nm, průměrování signálu 0,1 s, objem vzorku 80 µl.
• Termální rozkládání: fixní vlnová délka 280 nm, průměrování 2 s, ramp rate 0,1 °C/min, datový interval 0,1 °C, teplotní rozsah 25–90 °C, objem 70 µl.

Použitá instrumentace:

• Agilent Cary 3500 UV-Vis spektrofotometr s osmimístným Peltierově řízeným multicell modulem
• Ultra-mikrokyvety z křemene o optické délce 10 mm (objem 50–80 µl)
• Softwarové řízení a analýza dat Agilent Cary UV Workstation (s funkcemi pro vyhlazování a derivaci).

Hlavní výsledky a diskuse

Spektrofotometrické skeny sedmi současně měřených vzorků potvrdily maximální absorpční vrchol EcDsbA na 280 nm. Termální rozkládání ukázalo kooperativní přechod při teplotách nad 65 °C. Průměrná hodnota Tm činila 69,86 °C (n = 6) se standardní odchylkou 0,16 °C, což je v souladu s literárními údaji (68,55 °C a 69,25 °C získanými kruhovým dichroismem). Paralelní analýza sedmi buněk výrazně zrychluje sběr dat a zlepšuje reprodukovatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a přímá detekce změn proteinové struktury bez nutnosti fluorescenčních sond
• Minimální požadované objemy vzorku (50–80 µl)
• Vysoká teplotní a absorpční přesnost díky Peltierově blokům a integrované teplotní sondě
• Paralelní měření až osmi vzorků šetří čas a zajišťuje identické podmínky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody o vysokopropustné formáty pro screening ligandů a stabilizačních podmínek, integrace výsledků s laboratorními informačními systémy (LIMS) a využití v reálném čase pro kontrolu kvality (QA/QC). Potenciál automatizace měření a datové analýzy umožní další akceleraci vývoje bioterapeutik.

Závěr

Agilent Cary 3500 UV-Vis spektrofotometr s Peltierově řízeným multicell modulem prokázal vysokou přesnost, reprodukovatelnost a efektivitu při charakterizaci termální stability proteinů. Integrované softwarové nástroje pro analýzu Tm zajišťují rychlou a spolehlivou quantifikaci, vyhovující i přísným regulačním požadavkům.

Reference

1. Mohs RC, Greig NH. Drug Discovery and Development: Role of Basic Biological Research. Alzheimers Dement (NY). 2017;11(3–4):651–657.
2. Schenone M et al. Target Identification and Mechanism of Action in Chemical Biology and Drug Discovery. Nat Chem Biol. 2013;9(4):232–240.
3. Gashaw I et al. What Makes a Good Drug Target? Drug Discov Today. 2012;17(Suppl):S24–S30.
4. Jahn TR, Radford SE. Folding Versus Aggregation: Polypeptide Conformations on Competing Pathways. Arch Biochem Biophys. 2008;469(1):100–117.
5. Mateus A, Määttä TA, Savitski MM. Thermal Proteome Profiling: Unbiased Assessment of Protein State Through Heat-Induced Stability Changes. Proteome Sci. 2017;15:13.
6. Ball KA et al. An Isothermal Shift Assay for Proteome Scale Drug-Target Identification. Commun Biol. 2020;3:75.
7. Greenfield NJ. Using Circular Dichroism Collected as a Function of Temperature to Determine the Thermodynamics of Protein Unfolding and Binding Interactions. Nat Protoc. 2006;1(6):2527–2535.
8. Beychok S. Circular Dichroism of Biological Macromolecules. Science. 1966;154(3754):1288–1299.
9. Abd-Elghany M, Thomas MK. A Review on Differential Scanning Calorimetry Technique and its Importance in the Field of Energetic Materials. Phys Sci Rev. 2018;3:4.
10. Deangelis NJ, Papariello GJ. Differential Scanning Calorimetry. J Pharm Sci. 1968;57(11):1868–1873.
11. Pantoliano MW et al. High-Density Miniaturized Thermal Shift Assays as a General Strategy for Drug Discovery. J Biomol Screen. 2001;6(6):429–440.
12. Ericsson UB et al. Thermofluor-Based High-Throughput Stability Optimization of Proteins for Structural Studies. Anal Biochem. 2006;357(2):289–298.
13. Martin J, Bardwell JC, Kuriyan J. Crystal Structure of the DsbA Protein Required for Disulfide Bond Formation In Vivo. Nature. 1993;365:464–468.
14. Christensen S et al. Structural and Biochemical Characterization of Chlamydia trachomatis DsbA Reveals a Cysteine-Rich and Weakly Oxidising Oxidoreductase. PLoS One. 2016;11(12):e0168485.
15. Heras B et al. Staphylococcus aureus DsbA Does Not Have a Destabilizing Disulfide, a New Paradigm for Bacterial Oxidative Folding. J Biol Chem. 2008;283(7):4261–4271.