A Quick and Efficient Sample Cleanup for Biomolecule Analysis

Význam tématu

Analýza intactních biomolekul, jako jsou monoklonální protilátky, vyžaduje odstranění pomocných látek (pufry, detergenty, konzervační činidla), které by mohly ovlivnit výsledky LC/MS i životnost chromatografické kolony.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem článku je představit rychlou a snadno implementovatelnou metodu čištění vzorku pomocí centrifugační gelové filtrace, umožňující efektivní výměnu pufru a odstranění excipientů před LC/MS analýzou monoklonálních protilátek.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Centrifugační gelová filtrace s AdvanceBio Spin cartridgemi pro rychlou desaltaci a výměnu pufru.
• Příprava vzorku rituximabu v histidinovém pufru a výměna do bis-tris propane pufru.
• Analýza intactního proteinu reverzní fází (RP) s Agilent 1290 Infinity II Bio LC a 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF.
• Deglycosylace pomocí AdvanceBio Gly-X InstantPC a následné HILIC-LC/MS stanovení N-glykanů.

Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC system
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
• Kolony PLRP-S 1000 Å a AdvanceBio Amide HILIC
• AdvanceBio Spin columns (96-well a do 100 µL)
• Gly-X InstantPC labeling kit
• Centrifuga se swing-out rotorem
• Variabilní pipeta

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala téměř úplné odstranění NaCl a polysorbate 80 z formulace rituximabu bez ztráty integrity proteinu. Reverzní fázová LC/MS analýza vykázala výrazné snížení excipientů a zachování hlavního proteinu. Deconvoluce intaktní formy odhalila čtyři hlavní glykoformy (kombinace G0F, G1F, G2F). Uvolněné a InstantPC-značené N-glykany potvrzují distribuci odpovídající intactnímu profilu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a snadný postup (minuty) bez významných ztrát vzorku.
• Minimalizace rizika kontaminace detektoru a chromatografické kolony.
• Kompaktní formát vhodný pro vysokopropustné workflow.
• Univerzální aplikace pro různé typy biomolekul.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace metody do automatizovaných vysokopropustných platforem, online propojení s LC/MS systémy a adaptace na nové typy kartridží a mikrofluidických čipů. Dále rozšíření na analýzu komplexních matic v bioprocesním inženýrství.

Závěr

AdvanceBio Spin cartridges poskytují efektivní řešení pro čištění a přípravu vzorku monoklonálních protilátek před LC/MS analýzou. Nabízejí rychlý buffer exchange, odstranění excipientů a zajišťují reprodukovatelné, spolehlivé výsledky bez dopadu na strukturu biomolekul.

Reference

Andrew Coffey, Agilent Technologies, Inc. A Quick and Efficient Sample Cleanup for Biomolecule Analysis, Application Note 5994-7239EN, duben 2024.