Improved MS/MS Quality and Higher ID Rates Through Charge Tailored Collision Energies in dda-PASEF

Význam tématu

Kolizní energie (collision energy, CE) je klíčový parametr v DDA (data dependent acquisition) pracovních postupech, protože přímo ovlivňuje účinnost fragmentace peptidů a kvalitu MS/MS spekter. V platformách s iontovou mobilitou, jako je timsTOF s PASEF, závisí optimální CE nejen na m/z prekurzoru, ale také na jeho iontové mobilitě a nábojovém stavu. Globalizovaná, univerzální CE nastavení proto mohou vést k podoptimální fragmentaci, horší kvalitě spekter a nižšímu počtu identifikací — což má přímý dopad na citlivost proteomických a imunopeptidomických analýz.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo systematicky vyvinout a ověřit strategie volby kolizní energie, které berou explicitně v úvahu nábojovou třídu iontu a závislosti na m/z a/nebo iontové mobilitě, pro dda-PASEF na platformě timsTOF. Autoři vytvořili databázi naměřených CE hodnot, navrhli tři odlišné přístupy k výpočtu CE (m/z-based, ion-mobility-based, kombinovaný) a implementovali je v reálném čase prostřednictvím timsControl Python API. Studie hodnotila vliv těchto přístupů na kvalitu MS/MS spekter a počet identifikovaných peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická a výpočetní metodika:

• Sběr dat: 26 vzorků lidského digestu získaných s různými nastaveními CE pokrývající rozsah m/z 100–1750 a iontové mobility 0.65–1.35 Vs/cm²; režim dda_PASEF.
• Vyhledávání a metriky: vyhledávání provedené pomocí SAGE; extrakce metrik na úrovni peptidů a spekter, doplněná vlastními Python skripty.
• Hodnocení kvality MS/MS: sledované ukazatele zahrnovaly fragmentační míru, SAGE hyperscore, intenzity shodných fragmentů, součty intenzit b- a y-iontů a procento matched intensity.
• Optimalizace CE: určení optimálních CE pomocí boxplot statistiky, 2D binování (m/z vs 1/K0) a modelového fitování pro získání spojitých CE funkcí.
• Implementace: nasazení přizpůsobených CE funkcí během akvizice pomocí timsControl Python API s dynamickým plánováním prekurzorů a přiřazováním CE specifickým pro prekurzor.

Použitá instrumentace:

• timsTOF platforma (timsUltra AIP, nasazené softwarové kontrolní prostředí timsControl 7.0).
• Režim dda-PASEF pro akvizici dat s iontovou mobilitou.
• timsControl Python API pro změny akviziční strategie v reálném čase.
• Softwarové nástroje: SAGE pro vyhledávání proteomických dat a vlastní Python skripty pro analýzu a fitování CE povrchů.

Hlavní výsledky a diskuse

Vývoj a porovnání strategií:

• Navrženy tři nábojově dependentní strategie pro volbu CE: (a) pouze podle m/z, (b) podle iontové mobility (1/K0), (c) kombinovaný přístup vyjadřující závislost na m/z i 1/K0. Všechny tři byly implementovány interaktivně během akvizice.
• Výsledné spojité CE funkce byly odvozeny z experimentální databáze, identifikovány outliery a proveden fitting pro získání hladkých CE povrchů v prostoru m/z vs iontová mobilita.

Klíčové metriky zlepšení (optimalizovaný CE vs výchozí CE):

• Počet identifikovaných peptidů se zvýšil přibližně o 11 % napříč všemi nábojovými stavy oproti defaultní iontově orientované CE strategii.
• Systematické zlepšení kvality MS/MS spekter: fragmentační míra vzrostla z ~71 % na ~88 %; SAGE hyperscore průměrně z ~63.1 na ~77.2; MS2 intenzita a součty b/y fragmentů se významně zvýšily (např. součet b/y intenzit uveden v součtech nárůstu z řádů tisíců na řád desetitisíců v uvedeném příkladu).
• Matched intensity (%) a počet shodných fragmentních topů se rovněž zlepšily, což indikuje jak vyšší celkovou signálovou úroveň, tak lepší mapování fragmentů k teoretickým iontům.
• 2D rozdílové binovací mapy (m/z vs 1/K0) ukazují konzistentní zisk kvality rozprostřený napříč analyzovaným prostorem, nikoli jen v izolovaných oblastech.
• Manuální inspekce spekter s rozdílem CE ~4.6 eV ilustruje vyšší poměr signál/šum a lépe rozlišené série fragmentů po optimalizaci CE.

Význam nábojového členění: explicitní zahrnutí nábojového stavu do volby CE vedlo k jednotnějšímu a efektivnějšímu rozložení energie pro různé prekurzory a je hlavní příčinou zlepšení identifikací i kvality spekter. Všechny tři strategie vykazovaly podobný pozitivní efekt a překonaly defaultní iontově založené nastavení.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické dopady optimalizace CE v dda-PASEF:

• Zvýšení počtu identifikací peptidů (~11 %) vede ke zvýšení hloubky proteomického pokrytí bez změny akvizičního času.
• Zlepšená kvalita MS/MS spekter (vyšší intenzity fragmentů, lepší hyperscore) podporuje robustnější identifikace, přesnější lokalizaci modifikací a potenciálně lepší kvantitativní výstupy.
• Metoda je přímo použitelná při studiích s omezeným množstvím vstupu, v imunopeptidomice a v dalších aplikacích, kde je kritická citlivost a kvalita MS/MS spekter.
• Dynamická implementace CE při akvizici umožňuje flexibilní nasazení v rutinních i výzkumných pracovních postupech bez potřeby offline úprav dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího rozvoje a implementace:

• Integrace strojového učení pro adaptivní calibrování CE na bázi historie měření nebo vlastností konkrétních prekurzorů (např. sekvenční vlastnosti, modifikace).
• Rozšíření přístupů na jiné akviziční režimy (např. hybridní DIA/DDA strategie) či jiná zařízení s iontovou mobilitou.
• Vývoj per-peptidových nebo per-modifikačních CE modelů pro zvýšení přesnosti identifikací PTM a peptidů s neobvyklými vlastnostmi.
• Automatizované nasazení v klinických pracovních postupech, kde stabilní vysoká kvalita spekter a reprodukovatelnost jsou klíčové.

Závěr

Studie demonstruje, že zahrnutí nábojového stavu prekurzoru společně s m/z a/nebo iontovou mobilitou do výpočtu kolizní energie v dda-PASEF významně zvyšuje kvalitu MS/MS spekter a počet identifikací peptidů. Tři navržené přístupy byly úspěšně implementovány v reálném čase a prokázaly konzistentní zisky oproti defaultní metodě. Tento přístup má přímé aplikace v proteomice, zejména v náročných oblastech jako imunopeptidomika, a nabízí cestu k dalšímu zvýšení citlivosti a spolehlivosti hromadných proteomických analýz.

Reference

1. Lazear M. Sage: An Open-Source Tool for Fast Proteomics Searching and Quantification at Scale. Journal of Proteome Research. 2023;22(11).
2. Ulrike Schweiger-Hufnagel, Jens Decker, Stephanie Kaspar-Schoenefeld, Dennis Trede, Jonathan Krieger. Improved MS/MS Quality and Higher ID Rates Through Charge Tailored Collision Energies in dda-PASEF. Bruker Daltonics, 2026. (Poster/whitepaper; autoři zaměstnáni společností Bruker).