Thermo Scientific Glycan Analysis for Biotherapeutics

Význam tématu

Glykosylace bioterapeutických proteinů výrazně ovlivňuje jejich stabilitu, farmakokinetiku a imunogenicitu. Precizní charakterizace přidružených sacharidových struktur je proto nezbytná pro zajištění bezpečnosti a účinnosti léčiv. S růstem počtu glykoproteinových léčiv se zvyšují nároky na spolehlivé, vysoce výkonné analytické metody, jež pokrývají celou škálu od intactních proteinů až po volné monosacharidy.

Cíle a přehled článku

Článek představuje integrovanou sadu čtyř workflow pro komplexní analýzu glykánů u bioterapeutik:

• Intakt glykoproteiny
• Glykopeptidy
• Volné glykany
• Monosacharidy

Cílem je nabídnout jednoduché, opakovatelné a škálovatelné postupy pro izolaci, separaci, identifikaci a kvantifikaci sacharidových motivů v různých formátech vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow kombinuje sofistikované chromatografické a hmotnostně spektrometrické techniky:

• Separační fáze pro intactní glykoproteiny: MAbPac RP, HIC, IEC a SEC kolony s bio-compatibilními povrchy
• Hmotnostní analýza intactních proteinů: Orbitrap Exactive Plus EMR (rozlišení až m/z 20 000), dekonvoluční software Protein Deconvolution
• Glykopeptidové mapování: SMART Digest immobilizovaný trypsin, Vanquish UHPLC a Accucore/Acclaim RP kolony; fragmentační režimy HCD, ETD, EThcD na Orbitrap Fusion Lumos nebo Q Exactive; PepFinder™ software
• Analýza volných glykánů: enzymatické uvolnění N-glykosidázou PNGase F, značení 2-AB nebo aminoxyTMT, separace na GlycanPac AXH-1/AXR-1 kolónách, detekce fluorescenční i MS, software SimGlycan®
• Monosacharidová analýza: uvolnění a kyselé hydrolyzování sacharidů, separace CarboPac® Dionex kolony, HPAE-PAD na Dionex ICS-5000+/4000™ systémech

Hlavní výsledky a diskuse

Metody pro intactní proteiny umožňují vysokorozlišovací profilaci glykoform a kvantitativní stanovení variant protilátek. Glykopeptidové přístupy poskytují lokalizaci glykozylace na úrovni sekvence a relativní kvantifikaci PTM. Pro volné glykany je dosaženo oddělení i izomerů podle náboje a velikosti, včetně rychlého kvantitativního sledování pomocí multiplexních TMT značek. Monosacharidový přístup pak zajišťuje přesné stanovení složení Fuc, GalN, GlcN, Gal, Glc a Man.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow je optimalizován pro rutinní využití v R&D, QA/QC i komerčních laboratořích. Výhody:

• Vysoká reprodukovatelnost a robustnost
• Široké pokrytí analytických úrovní od intactních proteinů až po monosacharidy
• Rychlost a automatizace pro vysokou propustnost
• Kompatibilita s regulačními požadavky na charakterizaci bioterapeutik

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj se zaměří na další zvýšení throughputu a citlivosti, rozšíření multiplexních kvantifikací, integraci strojového učení pro interpretaci glyko­proteomických dat a nasazení nových materiálů pro ještě lepší separace izomerů. Real-time monitoring glykosylace v procesní analytice představuje další perspektivní oblast.

Závěr

Navržená sada workflow nabízí komplexní, modulární řešení pro detailní charakterizaci glykosylace bioterapeutických proteinů. Kombinace pokročilých chromatografických technik s HR/AM hmotnostní spektrometrií a moderním softwarem pokrývá všechny analytické úrovně a přináší efektivní nástroje pro vývoj a kontrolu kvality glykovaných léčiv.