Development of an MRM based phospholipid profiling method in human plasma using an inert C18 column

Význam tématu

Phospholipidy v lidské plazmě jsou klíčové pro pochopení metabolických stavů a patofyziologických změn. Detailní profilování složení phospholipidů umožňuje identifikovat potenciální biomarkery u onemocnění a podpořit personalizovanou medicínu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje vývoj metody založené na multiple reaction monitoring (MRM) pro komplexní profilování více než 170 phospholipidů v lidské plazmě. Hlavním cílem bylo dosáhnout vysoké citlivosti, reprodukovatelnosti a krátké analytické doby (20 minut) pomocí inertní C18 kolony.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: 20 µl lidské heparinizované plazmy, extrakce proteinovou precipitací s 1 ml methanolu obsahujícího 0,1 % kyseliny mravenčí, 3 µl supernatantu injikovány do LC-MS.
Chromatografie: Shim-pack Scepter Claris C18 (2,1×100 mm, 1,9 µm), teplota 50 °C, průtok 0,3 ml/min, mobilní fáze A – 20 mM formiátu amonného ve vodě, B – acetonitril/isopropanol (50/50), zakřivený gradient.
Hmotnostní spektrometrie: LCMS-8060NX s ultrarychlým triple kvadrupólem, ESI pozitivní/negativní režim se spínáním polarity za 5 ms, 662 MRM kanálů během 20 minut, dwell a pause time 1 ms, podmínky plynů: nebulizační 3 L/min, sušící 10 L/min, vyhřívací 10 L/min, DL 250 °C, blok 400 °C, interface 150 °C, tlak CID 270 kPa.

Hlavní výsledky a diskuse

Z celkem 170 detekovaných phospholipidů (130 diacylových, 28 lyso- a 12 sphingomyelinů) u 107 látek CV ≤20 %. Největší podíl v plazmě zaujímaly fosfatidylcholiny a lysofosfatidylcholiny. Metoda rozlišila strukturální isomery (např. PC 18:2_20:4 vs. 18:1_20:5) díky optimalizovanému gradientu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza (<20 min) a vysoká propustnost laboratoří.
• Vysoká reprodukovatelnost a nízké carry-over (<0,01 %).
• Možnost sledování omega-3 mastných kyselin (EPA, DHA) ve formě phospholipidů.
• Uplatnění v klinických studiích a výzkumu lipidomiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření MRM panelu o polarní lipidy a oxidované deriváty.
• Integrace s dalšími omickými technologiemi pro systémový pohled.
• Automatizace předzpracování a datové analýzy pro vyšší propustnost.
• Validace v klinických kohortách a personalizovaná medicína.

Závěr

Navržená MRM metoda na inertní C18 kolonu umožňuje spolehlivé profilování phospholipidů v lidské plazmě s vysokou reprodukovatelností, rozlišením isomerů a krátkým časem analýzy. Metoda představuje silný nástroj pro biomarker discovery a fyziologický výzkum.

Použitá instrumentace

• UHPLC Nexera
• Hmotnostní spektrometr LCMS-8060NX (Shimadzu)
• Kolona Shim-pack Scepter Claris C18, 2,1×100 mm, 1,9 µm

Reference

• Yamada M., Nagano N., Arao Y., Umakoshi Y. (2022) Development of an MRM based phospholipid profiling method in human plasma using an inert C18 column. Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.