Quantitation of Endogenous Steroids in Serum Using Dried Blood Spot Serum Separator Card and Triple Quadrupole Mass Spectrometry

Význam tématu

Endogenní steroidy jako kortisol, DHEAS, testosteron a progesteron jsou nezbytné pro udržení homeostázy, správnou funkci imunitního a reprodukčního systému a reakci na stres. Kvantifikace těchto hormonů v séru přináší cenné informace pro klinické a výzkumné aplikace, avšak tradiční odběr krevních vzorků metodou venepunkce je invazivní a logisticky náročný. DBS karty s oddělovací vrstvou séra nabízejí alternativu menšího objemu vzorku a možnosti odběru mimo laboratoř.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout a ověřit vysoce citlivou LC-MS/MS metodu pro simultánní stanovení čtyř klíčových endogenních steroidů ve vzorcích séra připravených na DBS sérových separačních kartách. Studie zahrnovala:

• Optimalizaci odběru vzorku na dvou typech DBS karet (30µL a 6µL).
• Porovnání dvou HPLC stacionárních fází (biphenyl vs. C18) pro minimalizaci matrix interferences.
• Vyhodnocení přesnosti, opakovatelnosti a korelace s tradičními imunometrickými testy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly připraveny spikingem komerčních steroidních standardů do odstripovaného lidského séra a aplikací na ADx DBS karty. Po vysušení následovalo extrakční čištění metodou dispersní SPE v pipetě (DPX XTR TIP) s Bind-Wash-Elute protokolem. Analytika probíhala na LCMS-8060NX spojeném s Nexera XR HPLC:

• Kolony Shim-pack Velox C18 (100×3,0 mm, 2,7 µm) nebo biphenylová fáze.
• Mobilní fáze: 0,1 mM amonný fluorid ve vodě a methanol se gradientem.
• Ionizace ESI v režimu +/−, MRM přechody optimalizované pro každý analyte.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda poskytla lineární rozsah pro jednotlivé analyty s koeficienty determinace r2 > 0,99. Přesnost kalibrace a QC úrovní dosahovala 80–120 % teoretických hodnot, intra- i interdenní opakovatelnost byla < 8 % RSD. Srovnání s imunotestem ukázalo rozdíly do 30 % napříč vzorky, což dokládá spolehlivost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje méně invazivní odběr a stabilní přepravu suchých vzorků, zjednodušuje logistiku a snižuje potřebu chlazení. Nízký objem vzorku a rychlá příprava přispívají k vyšší efektivitě v klinické laboratoři, farmakokinetických studiích i monitoringu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Během dalšího vývoje se počítá s rozšířením panelu hormonů (estron, estradiol, estriol, DHT, DHEA) a validací na dalších typech DBS karet. Automatizace přípravy a integrace do high-throughput platforem podpoří širší aplikace v klinických studiích, toxikologii a QA/QC sektoru.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda na DBS sérových separačních kartách prokazuje vysokou citlivost, přesnost a robustnost při stanovení endogenních steroidů. Nabízí praktickou alternativu k tradičnímu odběru krevního séra a má perspektivu dalšího rozšíření o další analyty v klinických i výzkumných kontextech.