Robust and sensitive quantitation of 18 steroids in human serum using Thermo Scientific TSQ Certis Triple Quadrupole mass spectrometer

Význam tématu

Analytická kvantifikace endogenních steroidů v lidském séru je klíčová pro klinický výzkum a monitorování hormonálních funkcí, reprodukce a imunitních odpovědí. Kvůli nízkým koncentracím a komplexnímu matricovému pozadí krevního séra vyžaduje analýza vysokou citlivost, selektivitu a opakovatelnost. LC–MS/MS s trojitém kvadrupólem zůstává zlatým standardem pro multiplexní stanovení steroidů díky své schopnosti rozlišit strukturně podobné analyty při nízkých hladinách.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout robustní a citlivou metodu pro současné kvantifikování 18 steroidů v lidském séru použitím Thermo Scientific TSQ Certis triple quadrupole MS v kombinaci s Vanquish Horizon UHPLC. Studie se zaměřila na optimalizaci ionizačních a měřicích parametrů, stanovení mezí kvantifikace, lineárního rozsahu, přesnosti a stability při vysoké průchodnosti vzorků.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Horizon
• MS: Thermo Scientific TSQ Certis triple quadrupole
• Ionizační zdroj: OptaMax Plus HESI (vaporizer optimalizován, finálně 525 °C)
• Kolona: Hypersil Gold C18, 2.1 x 100 mm, 1.9 µm
• Mobilní fáze: A – voda s 0,2 mM NH4F; B – methanol
• Přístrojové nastavení: SRM (selected reaction monitoring) režim; rychlé akviziční cykly vhodné pro multiplexní kvantifikaci
• Software pro zpracování dat: Thermo Scientific TraceFinder v5.2

Použitá metodika

Vzorky: Kalibrační standardy rozpuštěné v methanolu a interní standardy (izotopově značené) použity v 10 µL dávkách. Matricová báze pro kalibraci tvořena 0,05 % BSA v PBS, kalibrační roztok 10 µL + 10 µL IS + 160 µL BSA/PBS. Extrakce: proteinová precipitace pomocí ZnSO4 a ledově studeného acetonitrilu, následné vysušení a rekonstituce v 100 µL 50 % voda/methanol. Aplikována injekce 5 µL do LC–MS/MS. Kvantifikace: izotopová diluce s použitím řady značených interních standardů; konstrukce externích kalibračních křivek lineární regresí s vážením 1/x.

Optimalizace MS parametrů

Klíčovou optimalizací bylo nastavení teploty vaporizeru HESI zdroje. Testované rozmezí 300–600 °C odhalilo výrazné zvýšení signálu pro většinu steroidů; pro některé analyty (DHT, DHEA, Preg) byl nárůst signálu 6–14násobný. Jako kompromisní globální parametr byla zvolena teplota 525 °C, která poskytla stabilní a zvýšený signál napříč panelem analyzovaných steroidů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Citlivost a LOQ: Limity kvantifikace se pohybovaly v rozsahu přibližně 0,01–5,00 pg na kolonku (pg on column) v závislosti na konkrétním steroidu. Některé analyty, např. testosteron, dosahovaly LOQ kolem 0,01 pg o.c., zatímco pro některé steroidy byl LOQ až 5 pg o.c.
• Lineární rozsah: Kalibrační křivky pokrývaly až čtyři řády velikosti koncentrací s koeficienty determinace R2 > 0,99 pro všechny analyty.
• Přesnost a přesnost opakovatelnosti: Měřené koncentrace v komerčním kalibrátoru (6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set) a v kontrolních QCs byly v rámci přijatelných limitů; hodnoty byly do 30 % od očekávaných a většina %RSD byla pod 14 %.
• Robustnost: Stabilitu metody prokázalo 311 po sobě jdoucích injekcí kalibračních vzorků v 0,05 % BSA matrici. Relativní fluktuace ploch interních standardů měly %RSD < 17 %, což indikuje dobrou dlouhodobou stabilitu měření a reproducibilitu provozu.
• Selektivita: Použití SRM přechodů spolu s izotopově značenými interními standardy zajistilo spolehlivou identifikaci a kvantifikaci i u strukturně podobných steroidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost umožňuje detekci velmi nízkých endogenních hladin steroidů, vhodné pro klinické studie, endokrinologii a výzkum fyziologických odpovědí.
• Kratký 9minutový LC běh zvyšuje průchodnost a vhodnost pro vysokokapacitní laboratoře.
• Robustnost a nízká variabilita interních standardů podporují použití v rutinní QC/QA praxi.
• Multiplexní kvantifikace 18 steroidů v jednom běhu s izotopovou korekcí minimalizuje množství vzorku a laboratorní náklady na analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dále zlepšení zdrojových a akvizičních parametrů může umožnit ještě nižší LOQ pro slabě exprimované steroidy a metabolity.
• Rozšíření panelu analyzovaných látek o blízké metabolity a konjugované formy (sulfáty/glukuronidy) pro komplexnější metabolomické profily.
• Implementace automatizace přípravy vzorků a pokročilých QC algoritmů pro další zvýšení throughput a spolehlivosti v klinických laboratořích.
• Integrace dat s klinickými databázemi a zpracování pomocí strojového učení pro lepší interpretaci hormonálních vzorců ve velkých kohortách.

Závěr

Prezentovaná LC–MS/MS metoda na platformě Vanquish Horizon + TSQ Certis poskytuje citlivé, selektivní a robustní kvantifikování 18 steroidů v lidském séru. Optimalizace HESI zdroje a použití izotopově značených interních standardů umožnily dosáhnout nízkých LOQ, širokého lineárního rozsahu a stabilního provozu při vysoké průchodnosti vzorků. Metoda je vhodná pro výzkumné a vysoce výkonné klinické aplikace, kde jsou požadovány spolehlivé a opakovatelné výsledky.

Reference

1. Guo J., Patterson C., Maxey C., Wijeratne N., Hassell K. Robust and sensitive quantitation of 18 steroids in human serum using Thermo Scientific TSQ Certis Triple Quadrupole mass spectrometer. Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, United States. 2026. Application note (PO004707-2026-EN).