AdvanceBio Your Oligonucleotide Workflow

Význam tématu

V posledních letech nabývá syntetických oligonukleotidů (aptamery, siRNA, antisense oliga) zásadní význam v léčbě infekcí, nádorových onemocnění a dalších biomedicínských aplikacích. Pro zajištění účinnosti a bezpečnosti těchto molekul je klíčová přesná analýza vedlejších produktů syntézy a účinná purifikace cílových sekvencí.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje ucelené řešení Agilent AdvanceBio Oligonucleotide pro škálovatelné metody od analytické charakterizace po preparativní purifikaci oligonukleotidů. Představuje kompatibilní chemie kolon, analytické a preparativní postupy, software a instrumentaci minimalizující dobu optimalizace a přerušení provozu.

Použitá metodika

• Iontově párovaná reverzní fáze (IP-RP HPLC) s použitím aminu TEA a kyseliny HFIP pro analytické metody.
• Gradientní eluce (10–40 % organické fáze B) pro ostrou separaci krátkých oligoměrů N-1 až N-4.
• LC/MS analýza s DAD UV detekcí a Q-TOF pro detailní profilování hmotnostních stavů a identifikaci aduktů.
• Použití dibutylaminu (DBA) a TRIS jako nákladově výhodné alternativy HFIP pro preparativní purifikaci.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II UHPLC System.
• Agilent AdvanceBio Oligonucleotide analytické a preparativní kolony s částicemi 2,7 μm a 4 μm (superficially porous particle technologie).
• Agilent MassHunter BioConfirm 12.0 software pro automatizovanou analýzu a potvrzení sekvence.
• Agilent 6530 LC/Q-TOF a DAD UV detektor pro hmotnostní a spektrální detekci.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kolony AdvanceBio Oligonucleotide poskytují vysokou separační účinnost sub-2 µm při polovičním proti­tlaku oproti konvenčním částicím.
• Úspěšná separace DNA ladder standardu (15–40 mer) a RNA resolution standardu (14–21 mer) pro kvalifikaci sloupce.
• Optimalizované podmínky gradientu vedou k jasnému odlišení vedlejších produktů N-1 až N-4.
• Přímý přenos analytických metod na preparativní sloupce (21,2 mm i.d.) zajišťuje vysokou čistotu a výtěžnost frakcí.
• DBA/TRIS systém umožňuje hmotnostně řízenou purifikaci s nižšími náklady a vyšší rychlostí frakcionace.

Přínosy a praktické využití metody

• Ucelený workflow redukuje dobu optimalizace díky kompatibilitě kolon, softwaru a přístrojů.
• Škálovatelnost z analytického měřítka na preparativní usnadňuje přechod od QC k výrobě.
• Snížení spotřeby drahých fluorovaných činidel (HFIP) prostřednictvím DBA/TRIS alternace.
• Rychlejší charakterizace a purifikace usnadňuje vývoj nových oligonukleotidových terapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Budoucí vývoj se zaměří na zlepšení superficiálně porézních částic s vyšší kapacitou, prohloubenou integraci MS softwaru pro automatizovanou frakcionaci a optimalizaci iontově párovacích systémů s nižší spotřebou organických a fluorovaných látek. Další potenciál spočívá v adaptaci na nové třídy oligonukleotidů a rychlejších gradientních protokolů.

Závěr

Agilent AdvanceBio Oligonucleotide workflow představuje efektivní řešení pro precizní charakterizaci i preparativní purifikaci syntetických oligonukleotidů. Díky optimalizované stacionární fázi, výkonné instrumentaci a integračnímu softwaru lze dosáhnout vysoké separační účinnosti, reprodukovatelnosti a snížení provozních nákladů.

Reference

• Vanhoenacker G., Lecluyse C., Debyser G., Sandra P., Sandra K., Schipperges S., Schneider S., Huber U. Evaluation of Different Ion-Pairing Reagents for LC/UV and LC/MS Analysis of Oligonucleotides. Agilent Application Note.
• Rieck F. Fast and Selective Purification of Oligonucleotides Using Preparative HPLC/MS and Software Support. Agilent Application Note.