Fast and Selective Purification of Oligonucleotides Using Preparative HPLC/MS and Software Support

Význam tématu

Ion-pair reverzní fáze HPLC s detekcí MS je zásadní pro purifikaci syntetických oligonukleotidů, jejichž čistota přímo ovlivňuje účinnost a bezpečnost biotechnologických a farmaceutických aplikací. Náhrada nákladného HFIP a TEA cenově dostupnějšími činidly umožňuje škálovatelné a udržitelné procesy v průmyslové i výzkumné praxi.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace bylo vyvinout rychlou a selektivní metodu purifikace oligonukleotidů o délce pod 100 nukleotidů pomocí preparativní HPLC/MS. Metoda využívá dibutylamin (DBA) a TRIS jako ion-párová činidla a pufr, přičemž zachovává hromadné sbírání frakcí řízené masovými signály. Komparace s konvenční HA/HFIP metodou měla prokázat vyšší účinnost, nižší náklady a snadnější škálování.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografický systém: Agilent 1290 Infinity II Autoscale Preparative LC/MSD System
• Moduly: Binary Pump (G7161B), Quaternary Pump (G7111B) s aktivním proplachem, Open-Bed Sampler/Collector (G7158B), Multiple Wavelength Detector (G7165A), MS Flow Modulator (G7170B), MSD XT (G6135B)
• Software: Agilent OpenLab CDS ChemStation (C.01.10) a Automated Purification Software (A.01.08)
• Kolony: analytická Poroshell HPH-C18 (3×100 mm, 2.7 µm), preparativní Poroshell HPH-C18 (21.2×150 mm, 4 µm)
• Ion-párová činidla: hexylamin (HA) + HFIP pro analýzu; dibutylamin (DBA) + TRIS pufr pro preparativu
• Make-up solvent pro MS: 0.1 % formiová kyselina v metanol/voda (70/30)

Hlavní výsledky a diskuse

• Analytické separace na HA/HFIP metodě prokázaly schopnost rozlišit Full-Length Product (FLP) od vedlejších fragmentů obou oligonukleotidových vzorků (30–50 nt).
• Automatizovaný modul gradientů vypočetl „focused“ gradient na základě vybraného piku, což zkrátilo dobu rozlišení a usnadnilo přenos metody na preparativní kolonu.
• Při preparativní purifikaci s DBA/TRIS aktivní splitter a make-up solvent zajistily MS-řízený sběr frakcí logickou podmínkou AND s UV, což výrazně snížilo množství nepotřebných frakcí.
• Reanalýza frakcí ukázala, že většina frakcí dosahuje čistoty nad 99 %; první časový úsek byl cíleně vyřazen pro eliminaci raných nečistot.
• Metoda umožňuje snadné škálování díky použití stejného typu SPP kolon na analytické i preparativní úrovni, a to při zachování vysokého průtoku až 25 mL/min.

Přínosy a praktické využití metody

• Významné snížení nákladů na ion-párová činidla nahrazením HFIP TRIS pufrem.
• Rychlá a vysoce selektivní purifikace oligonukleotidů s minimálními zásahy operátora.
• Automatizace tvorby gradientů a řízení frakční sběru zvyšuje produktivitu a spolehlivost v QA/QC a výzkumných laboratořích.
• Unifikace analytických a preparativních podmínek usnadňuje validaci a přenos metodologie mezi laboratořemi i škálami.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace pokročilých softwarových nástrojů pro plně automatizované end-to-end purifikační procesy a reportování kvality.
• Další vylepšení ion-pair reagentů a SPP kolon pro vyšší rozlišení a rychlost rozdělení komplexních vzorků.
• Rozšíření metody na dlouhé RNA molekuly, chemicky modifikované oligonukleotidy a multi-komponentní biologické směsi.
• Kombinace s vysoce-rozlišovacími detektory (HRMS, vícekanálové UV spektrometry) a on-line kvalimetrickými nástroji.

Závěr

Použití preparativní HPLC/MS s DBA/TRIS na Agilent Poroshell HPH-C18 kolony ve spojení s automatizovanou softwarovou podporou nabízí rychlou, selektivní a ekonomickou cestu k purifikaci krátkých oligonukleotidů. Metoda dosahuje vysokých čistot (>99 %) a je snadno škálovatelná mezi analytickou a preparativní úrovní pro výzkum i průmyslové aplikace.

Reference

1. Catani, M. et al. Oligonucleotides: Current Trends and Innovative Applications in the Synthesis, Characterization, and Purification. Biotechnology Journal 2020, 15, 8.
2. Evaluation of Different Ion-Pairing Reagents for LC/UV and LC/MS Analysis of Oligonucleotides. Agilent Technologies Application Note, 5994-2957EN, 2021.
3. Purification of Single-Stranded RNA Oligonucleotides Using High-Performance Liquid Chromatography. Agilent Technologies Application Note, 5994-3514EN, 2021.