Multiple Analytical Techniques For Carotenoid Analysis In Capsicum Cultivars

Význam tématu

Analýza karotenoidů v plynových a kapalných frakcích papriček rodu Capsicum představuje klíčový nástroj v potravinářském, výživovém i farmaceutickém průmyslu. Karotenoidy ovlivňují barvu, nutriční hodnotu (provitamín A) a antioxidační vlastnosti potravin. Přesné stanovení volných a esterifikovaných forem umožňuje sledovat kvalitu, stupeň zralosti a autenticitu výrobků, stejně jako jejich stabilitu a biologickou dostupnost.

Cíle a přehled studie / článku

Práce se zaměřila na porovnání a optimalizaci několika extrakčních a chromatografických postupů pro identifikaci a separaci karotenoidů v různých druzích Capsicum. Hlavními cíli byly:

• Vyvinout on-line propojení superkritické extrakce a superkritické kapalinné chromatografie (SFE–SFC) pro rychlou a přesnou analýzu.
• Ověřit možnosti reverzní fáze HPLC s jedním či dvěma sériově spojenými C30 kolony pro rozlišení volných a esterifikovaných karotenoidů.
• Navrhnout a aplikovat komplexní NP-LC×RP-LC a NP-LC×UHPRP-LC systémy pro detailní rozlišení a identifikaci desítek látek.

Použitá metodika a instrumentace

SFE–SFC
V on-line uspořádání byla extrakce karotenoidů z mletého vzorku habanera (Capsicum chinense) prováděna pomocí superkritického CO2 modifikovaného methanolem. Extrakt byl přímo přiváděn do SFC kolony (C30, 2,7 µm), eluován gradientem CO2/methanol a detekován trojitým kvadrupólem s APCI. Teplota extrakčního lože se testovala od 40 °C do 80 °C, dávky CO2 a gradient methanolu byly optimalizovány pro maximální výtěžek.

RP-HPLC
Použití jedné nebo dvou sériově spojených C30 kolonek (250×4,6 mm, 5 µm) s mobilní fází methanol/MTBE/voda ve formě lineárního gradientu. Detekce UV–Vis (450 nm, spektrum 250–600 nm) a APCI-MS (SCAN, SIM, MRM) umožnily rozlišení volných karotenoidů i mono- a diesterů.

NP-LC×RP-LC a NP-LC×UHPRP-LC
První dimenze: cyano mikrokolona (250×1,0 mm, 5 µm) s hexan-butylacetát-acetonem. Druhá dimenze: reverzní fáze C18 fused-core (30×4,6 mm, 2,7 µm), napojená cyklickými výměnnými ventily. Gradienty a modulační časy (0,75 až 1,50 min) byly optimalizovány pro rychlé on-line střihy frakcí. V UHPLC verzi se dvěma sloupci C18 byla dosažena vyšší rychlost a rozlišení.

Použitá instrumentace

• Systém Shimadzu Nexera-UC pro SFE a SFC, modul SFE-30A, SFC-30A, CO2 pumpy, BPR, detektor LCMS-8050 QqQ s APCI.
• HPLC systém Shimadzu (CBM-20A, LC-20AD, DGU-20A, CTO-20AC, SIL-30AC, SPD-M20A PDA, LCMS-2020 s APCI).
• Nexera-e LC×LC-UHPLC systém (CBM-20A, čtyři LC-30AD pumpy, DGU-20A5, CTO-20A/CTO-30A, SIL-30A, SPD-M20A), LCMS-IT-TOF s APCI.

Hlavní výsledky a diskuse

SFE–SFC umožnilo extrakci a chromatografii v jednom běhu (18 min), s vysokou opakovatelností a nízkým rizikem kontaminace. Optimalizace teploty extrakce přinesla maximální výtěžky (do 48 % primární extrakce). RP-HPLC s dvojitou C30 kolonu zvýšila kapacitu špiček z 73 na 95 (zlepšení rozlišení kritických párů). NP-LC×RP-UHPLC s modulačním časem 1 min dosáhlo praktické kapacity nC = 984, identifikovalo 33 karotenoidů ve 10 chemických třídách (volné hydrocarbony, xanthofyly, monoesters, diesters, epoxidy, ketony apod.). Red sweet bell pepř obsahoval ~33 % volných, 33 % monoesterů a 33 % diesterů, přičemž převládaly di-ol-mono-keto monoestery (~36 %). Esterace výrazně přibývá s dozráváním plodu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá on-line extrakce i separace s možností sériové produkce dat.
• Minimální chemické úpravy vzorku, snížení artefaktů a degradace karotenoidů.
• Důkladné rozlišení isomerů, mono- a diesterů, klíčových pro hodnocení zralosti a stability.
• Univerzální aplikace na různé kultivary Capsicum a potravinářské produkty.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na kvantitativní validaci metod, rozšíření referenčních standardů pro méně dostupné karotenoidy a automatizaci datové analýzy. Kombinace více dimenzí (LC×LC×MS), High-Resolution MS a softwarové knihovny fragmentačních vzorů umožní detailní profiling a aplikaci v toxikologii, metabolomice i kvalitě potravin. Vznikají perspektivy pro in-line monitorování zpracovatelských procesů a hodnocení nových plodin či extraktů.

Závěr

Studie ukazuje, že integrace on-line SFE-SFC, sériových C30 HPLC a dvourozměrného NP-LC×RP-UHPLC poskytuje ucelený přístup k analýze rozmanitých forem karotenoidů v paprikách. Kombinace rychlosti, rozlišení a citlivosti posouvá hranice možného v průmyslové kontrole kvality i vědeckém výzkumu.

Reference

1. Giuffrida D. a kol. Food Chem. 140 (2013) 794–802.
2. Kopsell D.A., Kopsell D.E. Bioactive Food in Promoting Health, Academic Press, 2010.
3. Beutner S. a kol. J. Sci. Food Agric. 81 (2001) 559–568.
4. Minguez-Mosquera M.I., Hornero-Mendez D. J. Agric. Food Chem. 42 (1994) 640–644.
5. Hornero-Mendez D., Minguez-Mosquera M.I. J. Agric. Food Chem. 48 (2000) 1617–1622.
6. Schweiggert U. a kol. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19 (2005) 2617–2628.
7. Dugo P. a kol. J. Chromatogr. A 1189 (2008) 196–201.
8. Dugo P. a kol. J. Agric. Food Chem. 56 (2008) 3478–3482.
9. Dugo P. a kol. Anal. Chem. 78 (2006) 7743–7751.
10. Donato P. a kol. J. Chromatogr. A 1216 (2009) 7483–7490.
11. Dugo P. a kol. J. Sep. Sci. 32 (2009) 973–980.
12. Dugo P. a kol. J. Sep. Sci. 31 (2008) 3297–3304.
13. Dugo P. a kol. J. Chromatogr. A 1216 (2009) 7213–7220.
14. Neue U.W. J. Chromatogr. A 1079 (2005) 153–161.
15. Gu H., Huang Y., Carr P.W. J. Chromatogr. A 1218 (2011) 64–70.
16. Liu Z. a kol. Anal. Chem. 67 (1995) 3840–3848.
17. Philip T., Chen T.S. J. Food Sci. 52 (1987) 1071–1073.
18. Sun T. a kol. J. Food Sci. 72 (2007) S98–S102.
19. Azevedo-Meleiro C.H., Rodriguez-Amaya D.B. J. Sep. Sci. 32 (2009) 3652–3658.
20. Matsufuji H. a kol. Int. J. Food Sci. Technol. 42 (2007) 1482–1488.
21. Guil-Guerrero J.L. a kol. Eur. Food Res. Technol. 224 (2006) 1–9.
22. Marin A. a kol. J. Agric. Food Chem. 52 (2004) 3861–3869.