Ultra high pressure comprehensive two-dimensional liquid chromatography combined with hybrid mass spectrometry for the elucidation of carotenoids in red chili peppers

Význam tématu

Carotenoidy jsou biologicky aktivní pigmenty s významnými nutričními a technologickými vlastnostmi. Jejich detailní analýza v potravinách, jako jsou červené chilli papričky, podporuje kontrolu kvality, sledování složení a studium zdravotních přínosů. Kombinace dvourozměrné kapalinové chromatografie a vysoké přesnosti hmotnostní spektrometrie nabízí hluboký vhled do komplexního složení a usnadňuje identifikaci nízkomolekulárních i málo zastoupených látek.

Cíle a přehled studie / článku

Studie si klade za cíl vyvinout a otestovat novou NP-LC×RP-UHPLC metodu v kombinaci s hybridním MS (LCMS-IT-TOF) pro detailní fingerprinting karotenoidů v extraktu z červené chilli papričky. Metoda je porovnána se standardní NP-LC×RP-LC konfigurací ve třech různých provozních nastaveních (set up #1–#3) z hlediska kapacity špiček, ortogonality separace a podvzorkování 1D frakcí.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika extrakce:

• Red chili pepper (Capsicum annuum L.) extrahována směsí methanol/ethylacetát/petrolether (1:1:1, v/v/v).

Chromatografické separace:

• 1. dimenze (NP): Ascentis ES Cyano, 250×1,0 mm, 5 µm; mobilní fáze n-hexan / butylacetát / aceton.
• 2. dimenze (RP): Ascentis Express C18 (1 ×) nebo dvě sériově zapojené 30×4,6 mm kolony, 2,7 µm; mobilní fáze voda/ACN (10:90) a isopropanol.
• Modulační časy: 0,75 min (set up #1), 1,50 min (set up #2) a 1,00 min (set up #3) se specifickými gradienty.

Instrumentace:

• Shimadzu Nexera LC-30A
• SPD-M20A fotodiodový detektor (250–550 nm)
• LCMS-IT-TOF s APCI (+/–), 200–1200 m/z, rychlé přepínání polarity
• Dvoupolohové šestikusové vysokotlaké ventily pro LC×LC rozhraní
• Software: LCMSsolution® 3.50, Chromsquare® 1.5.

Hlavní výsledky a diskuse

Standardní NP-LC×RP-LC (set up #1) rozdělila karotenoidy do 10 tříd podle polarity a hydrofobicity. Přechod na NP-LC×RP-UHPLC zvýšil separační výkon, zejména pro volné xantofyly a diol-mono-keto estery. Zkrácení modulačního času na 1,00 min (set up #3) dále zvýšilo efektivitu frakcionace a zlepšilo rozlišení v 2D mapách. Hybridní MS-IT-TOF umožnila odlišit izomerické sloučeniny se stejnými UV spektry (např. dvě diol-mono-keto-diesterové formy kapsanthinu) na základě charakteristických fragmentačních vzorců. Celkem bylo bez standardů identifikováno až 33 různých karotenoidů ve volné i esterifikované formě. Tabulka 2 ukazuje srovnání teoretické, korektované (ortogonalita) a efektivní kapacity špiček, přičemž set up #3 dosáhl nejvyšší efektivity (984).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší:

• Vyšší rozlišovací schopnost pro komplexní směsi
  
• Spolehlivou identifikaci nízkomolekulárních a izomerických látek
  
• Robustní kvantifikaci a snížení suprese iontů
  
• Automatizované zpracování a reprodukovatelnost vhodnou pro QA/QC v potravinářství

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje:

• Integrace MSn a vysokého rozlišení pro detailnější strukturální analýzu
• Další zrychlení běhu a miniaturizace chromato­grafických systémů
• Využití strojového učení pro automatickou dekonvoluci 2D dat
• Rozšíření aplikace na další biologické matrice a funkční složky

Závěr

Popisovaná NP-LC×RP-UHPLC/MS metoda prokázala významné zlepšení separačního výkonu i identifikační síly oproti konvenčnímu LC×LC. Umožnila detailní fingerprinting a strukturální odlišení více než 30 karotenoidů v extraktu z červené chilli papričky bez nutnosti referenčních standardů.

Reference

V textu nejsou uvedeny specifické bibliografické reference.