Mass spectrometric elucidation of carotenoids in red chili peppers using high pressure comprehensive two-dimensional liquid chromatography

Význam tématu

Analýza karotenoidů v chilli papričkách je klíčová pro stanovení jejich nutriční hodnoty a biologické aktivity. Komplexní vzorky vyžadují techniky s vysokou separační výkoností a citlivostí pro oddělení izomerů a esterů karotenoidů. Nasazení multidimenzionální chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií přináší detailní profilace těchto látek a podporuje kvalitu potravinářských i farmaceutických aplikací.

Cíle a přehled studie

Studie představuje inovativní kombinaci normálněfázové LC× reverzněfázové UHPLC pro analýzu volných karotenoidů a jejich esterů v chilli papričkách Capsicum annuum. Hlavní cíle byly:

• Optimalizovat modulaci a gradienty ve 2D pro zvýšení separační kapacity
• Porovnat tři konfigurace systému s ohledem na kapacitu, ortogonalitu a podvzorkování
• Vyhodnotit schopnost LCMS-IT-TOF v identifikaci karotenoidů bez potřeby standardních sloučenin

Použitá metodika

Chromatografická analýza zahrnovala přípravu extraktu z chilli papriček rozpouštědly methanol ethylacetát a petrolether v poměru 1:1:1. Rozdělení probíhalo v první dimenzi na microbore kolóně Ascentis ES Cyano 250×1,0 mm; 5 μm s fázemi n-hexan a směsí hexan butylacetát acetonu. Ve druhé dimenzi se uplatnily dvě sériově spojené C18 kolony Ascentis Express 2,7 μm; 30×4,6 mm s mobilní fází voda ACN–IPA a modulací od 0,75 do 1,50 min při různých gradientních programech.

Použitá instrumentace

• LC×LC systém Shimadzu Nexera LC-30A
• Detektor SPD-M20A Photo Diode Array 250–550 nm
• LCMS-IT-TOF s APCI ionizací v režimu pozitivním a negativním
• Rozhraní LC×LC se dvěma rychlými přepínacími ventily 6 portů
• Software LCMSsolution verze 3.50 pro řízení a Chromsquare verze 1.5 pro vizualizaci dat

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky ukázaly výrazné zlepšení separace volných karotenoidů a jejich esterů při zkrácení modulačního času na 1,00 min a použití krokového gradientu. Vizualizace 2D konturových ploch odhalila odlišení až 10 tříd sloučenin podle polarity a hydrofobicity. MS-IT-TOF dokázal rozlišit strukturálně podobné diol-monoketo-diestery na základě fragmentačních iontů a hmotnostní přesnosti. Celkem bylo pozitivně identifikováno 33 karotenoidů bez standardů. Tabulkově vyhodnocená kapacita nC tří konfigurací ukázala nárůst efektivního nC ze 727 na 984 při použití setupu 3.

Přínosy a praktické využití metody

• Detailní profilace karotenoidů pro potravinářskou a farmaceutickou kontrolu kvality
• Možnost identifikace i nízkokoncentrovaných izomerů bez standardních látek
• Zvýšená robustnost a opakovatelnost díky automatizované multidimenzionální chromatografii

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací na další komplexní biologické matice a doplnění o vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrii třetí dimenze. Optimalizace modulace a gradientů může dále zvýšit separační výkon a umožnit kvantifikaci nových karotenoidních derivátů. Integrace s databázovými nástroji podpoří rychlejší automatizovanou identifikaci.

Závěr

Multidimenzionální NP-LC×RP-UHPLC v kombinaci s MS-IT-TOF představuje výkonnou platformu pro komplexní analýzu karotenoidů. Zkrácením modulačního cyklu a optimalizací gradientů se významně zlepšila separační kapacita a třídění látek. MS-MS fragmentace umožnila spolehlivou strukturní elucidaci bez nutnosti standardů a otevřela cestu k širokému využití v potravinářské i farmaceutické praxi.