Assessing Protein and Payload Stability of Antibody Drug Conjugate Brentuximab Vedotin in Monkey Plasma

Význam tématu

Antibody–drug konjugáty (ADC) představují novou třídu cílené protinádorové léčby, která kombinuje specifitu monoklonálních protilátek s vysokou účinností cytotoxických látek. Stanovení stability jak proteinové složky, tak cytotoxického náboje v biologických matricích je klíčové pro optimalizaci designu léčiva, zajištění konzistence výroby a predikci klinických výsledků. Při vývoji ADC je nezbytné přesně kvantifikovat oba komponenty, což tradiční ligand binding assay (LBA) neumí poskytovat s dostatečnou mírou detailu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo vyvinout plně automatizovaný workflow pro kvantitativní stanovení stability proteinu a náboje u ADC brentuximab vedotinu v opičí plasmatické matrici. Metoda spojuje imunoafinitní extrakci na platformě Agilent AssayMAP Bravo se separací a detekcí pomocí Agilent 1290 Infinity II Bio LC a Agilent 6495 triple quadrupole LC/MS. Studie demonstruje linearitu metody, dosahované citelnosti i reprodukovatelnost výsledků při sledování stability v čase.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow se skládá z následujících kroků a přístrojů:

• Platforma Agilent AssayMAP Bravo pro automatizovanou imunoafinitní extrakci: streptavidinové a Protein A cartridge, blokování BSA, naložení vzorku, promývání a eluční kroky.
• Trypsinová in-solution digesce pro uvolnění surrogate peptidu z protilátky: redukce DTT, alkylace iodoacetamidem a noční digesce.
• Papainová reakce pro uvolnění cytotoxického náboje (MMAE) z ADC na cartridgích.
• Chromatografie na Agilent Poroshell 120 EC-C18 (2,1×50 mm, 2,7 μm) v Bio LC systému s gradientem vody a acetonitrilu (oba s 0,1 % FA) při 0,4 mL/min a 60 °C.
• Detekce na Agilent 6495 triple quadrupole LC/MS v režimu pozitivního ESI a MRM přechodech pro surrogate peptid VVSVLTVLHQDWLNGK, stabilně značený analog a MMAE se standardem MMAE-d8.

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivky pro surrogate peptid i payload byly lineární v rozsahu 0,39–50 μg/mL s hodnotami R2 nad 0,99. Sledování stability ukázalo, že surrogate peptid zůstává v plasmatické matrici stabilní po dobu 7 dnů při 37 °C, zatímco koncentrace MMAE klesla o ~40 % během prvního dne a o dalších ~25 % do třetího dne, poté se stabilizovala. Výsledky potvrzují vysokou citlivost, specifičnost a reprodukovatelnost workflow i jeho robustnost při dlouhodobém sledování stability.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizované spojení LBA a LC/MS umožňuje rychlý vývoj metody bez nutnosti specifických protilátek pro každý ADC. Univerzální surrogate peptid platí pro většinu lidských IgG, což zkracuje čas potřebný k validaci nových konjugátů. Metoda přináší vysokou míru citlivosti a selektivity, minimalizuje složitost vzorku a zvyšuje throughput, což je klíčové pro projekty výzkumu a vývoje biologických léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj multiplexních LC/MS metod umožní současné sledování více ADC a metabolit v jediném běhu. Integrace vyšších řádů hmotnostní spektrometrie (např. QTOF, Orbitrap) přinese detailní karakterizaci modifikací a distribuce nábojů (DAR). Automatizace na platformách jako AssayMAP Bravo bude dále zvyšovat throughput a standardizaci laboratorních procesů.

Závěr

Navržené hybridní workflow spojuje výhody imunoafinity, automatizace a LC/MS detekce pro kvantitativní stanovení stability ADC brentuximab vedotinu. Metoda nabízí vysokou přesnost, reprodukovatelnost a univerzální využitelnost pro další mAb nebo ADC projekty, což podporuje efektivní vývoj a validaci biologických léčiv.

Reference

1. Global Market Insights. Antibody Drug Conjugates Market Analysis 2023–2032.
2. Jenkins R., et al. Recommendations for Validation of LC–MS/MS Methods for Protein Biotherapeutics. AAPS J. 2015;17(1):1–16.
3. Dailymed. Adcetris (brentuximab vedotin) Injection. U.S. National Library of Medicine.
4. European Medicines Agency. EPAR: Adcetris.
5. Agilent Technologies. A Streamlined Drug-to-Antibody Ratio Determination Workflow. Application Note 5991-9010EN; 2019.