A streamlined drug-to-antibody ratio determination workflow for intact and deglycosylated antibody-drug conjugates

Význam tématu

Antibody-drug conjugáty (ADC) kombinují specifitu monoklonální protilátky s cytotoxickou silou malého molekulárního léčiva. Poměr připojených molekul léčiva k protilátce (DAR) je klíčovým atributem ovlivňujícím účinnost a bezpečnost ADC. Spolehlivá stanovení průměrného DAR i jeho distribuce v krvi mohou odhalit biotransformační procesy, jako je dekonjugace drogy, a tím podpořit vývoj a monitorování ADC v in vivo studiích.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a demonstrovat plně automatizovaný, škálovatelný a vysoce reprodukovatelný pracovní postup pro izolaci ADC ze séra, následnou deglykozylaci a LC/MS analýzu k určování DAR. K tomu byla využita platforma Agilent AssayMAP Bravo, LC/Q-TOF systém Agilent 6545XT AdvanceBio a softwarové nástroje Agilent BioConfirm a DAR Calculator.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje tři hlavní kroky prováděné na AssayMAP Bravo:

• Imobilizace biotinylovaného antigenu HER2 ECD na streptavidinové kazety (SA-W).
• Affinity čištění ADC (trastuzumab-emtansine, T-DM1) ze séra pomocí vázaného antigenu.
• On-cartridge deglykozylace PNGase F k odstranění různých glykoforem a zjednodušení masového spektra.

Vyčištěné a deglykozylované vzorky byly analyzovány UHPLC (Agilent 1290 Infinity II, kolona PLRP-S) spojenou s Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF MS. Data byla zpracována v MassHunter BioConfirm (dekonvoluce) a DAR Calculator (výpočet DAR).

Hlavní výsledky a diskuse

Pracovní postup trvá cca 4,5 h s méně než 30 min hands-on time a zvládne paralelní přípravu až 96 vzorků. Reprodukce byla vynikající (CV < 10 % pro většinu koncentrací). Linearita kvantifikace (EIC, 2 000–4 000 m/z) měla R² > 0,998 pro 3,125–100 ng na kolonu. Průměrné DAR u T-DM1 se pohybovalo stabilně kolem hodnoty 3,5 ± 0,1 napříč celou dynamickou oblastí. Deglykozylace zjednodušila dekonvoluované spektrum a zlepšila citlivost a jistotu stanovení DAR zejména při nízkých koncentracích.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální manuální zásahy a riziko chybných manipulací.
• Škálovatelné zpracování většího počtu vzorků ve stejném čase.
• Rychlé a spolehlivé stanovení DAR pro podporu vývoje a kontroly kvality ADC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směry zahrnují integraci dalších kroků přípravy vzorku, aplikaci na různé typy ADC a jiné konjugáty, nasazení iontově mobilní hmotnostní spektrometrie pro ještě lepší rozlišení glykoforem a multiplexní analýzy několika ADC najednou. Dále je perspektivní aplikace ve farmakovigilančním monitorování a personalizované medicíně.

Závěr

Automatizovaný workflow na platformě AssayMAP Bravo spolehlivě zjednodušuje izolaci, čištění a deglykozylaci ADC ze séra a v kombinaci s LC/Q-TOF analýzou poskytuje robustní, reprodukovatelnou a škálovatelnou metodu pro přesné určování DAR. Tento přístup urychlí a zlevní analýzy během preklinického a klinického vývoje ADC.

Reference

1. Peters C., Brown S. Antibody-drug conjugates as novel anti-cancer chemotherapeutics. Biosci Rep. 2015;35(4).
2. Beck A. et al. Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates. Nat Rev Drug Discov. 2017;16(5):315-337.
3. Xu K. et al. Characterization of intact antibody-drug conjugates from plasma/serum in vivo by affinity capture capillary liquid chromatography-mass spectrometry. Anal Biochem. 2011;412(1):56-66.
4. Wei C. et al. Where Did the Linker-Payload Go? A Quantitative Investigation on the Destination of the Released Linker-Payload from an Antibody-Drug Conjugate with a Maleimide Linker in Plasma. Anal Chem. 2016;88(9):4979-4986.
5. Agilent Technologies. Agilent AssayMAP Bravo Platform. 2019.
6. Agilent Technologies. Agilent AssayMAP Bravo Cartridges for Automated Protein Sample Preparation Workflows. 2019.
7. Wu S., Shen M. An Integrated Workflow for Intact and Subunits of Monoclonal Antibody Accurate Mass Measurements. Agilent Technologies Application Note. 2018.
8. Huang R. Y.-C. et al. Utility of Ion Mobility Mass Spectrometry for Drug-to-Antibody Ratio Measurements in Antibody-Drug Conjugates. J Am Soc Mass Spectrom. 2015;26(10):1791-1794.
9. Krop I. E. et al. Phase I study of trastuzumab-DM1, an HER2 antibody-drug conjugate, given every 3 weeks to patients with HER2-positive metastatic breast cancer. J Clin Oncol. 2010;28(16):2698-2704.