Development and Optimization of a HILIC- MS Separation of 17 Free Amino Acids using an XBridge Premier BEH Amide Column

Význam tématu

Polarita volných aminokyselin ztěžuje jejich separaci běžnými chromatografickými technikami.
HILIC nabízí lepší retenci vysoce polárních látek díky adsorpci vodné vrstvy na stacionární fázi a multipolárním interakcím.
Tato metoda je klíčová pro biochemické analýzy, potravinářskou kontrolu a farmaceutický výzkum.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo systematicky vyvinout a optimalizovat HILIC-MS separaci 17 volných aminokyselin.
Postup zahrnoval screening stacionárních fází a pH mobilní fáze, následně optimalizaci gradientu vodné fáze i pufru.
Konečná metoda kombinuje gradient vodné fáze (5–50 %) a gradient pufru (10–50 mM ammonium formate, pH 3) na kolonos XBridge Premier BEH Amide.

Použitá metodika

• Screening tří HILIC stacionárních fází (BEH Amide, BEH Z-HILIC, CORTECS HILIC) při nízkém (pH 3) i vysokém pH (pH 9).
• Hodnocení rozlišení izobarického páru isoleucin/leucin a tvaru píků ostatních aminokyselin.
• Optimalizace zahrnovala úpravu strmosti gradientu vodné fáze a zavedení gradientu koncentrace pufru.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Plus System s Quaternary Solvent Manager a QDa detektorem (ESI+).
• Kolona XBridge Premier BEH Amide 2,1×50 mm, 2,5 µm.
• Mobilní fáze A: voda; B: acetonitril; D1: 200 mM ammonium formate pH 3.
• Teplota kolony 30 °C, vzorku 10 °C; objem injekce 1 µL; průtok 0,15 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

• Nejlepší screeningové výsledky poskytla BEH Amide kolona s pH 3 mobilní fází.
• Gradient vodné fáze 5–50 % s konstantním 10 mM pufrem poskytl základní rozlišení, ale objevily se širší píky.
• Gradient pufru 10–50 mM zlepšil rozlišení izobarického páru isoleucin/leucin z 1,26 na 1,69 a většinu píků zbavil asymetrie.
• Konečná metoda vykazuje USP tailing faktory mezi 0,8–1,2 pro většinu aminokyselin; u čtyř složek dosáhly hodnoty až 1,7.

Přínosy a praktické využití metody

• Zajištěno spolehlivé rozlišení kritických izobarických párů.
• Eliminace nežádoucích interakcí s kovovým hardwarem díky povrchové úpravě MaxPeak HPS.
• Systematický přístup umožňuje rychlý přenos do QA/QC laboratoří a výzkumných pracovišť.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na další polární metabolity v metabolomice a klinických aplikacích.
• Automatizace optimalizace metod pomocí pokročilých softwarových nástrojů.
• Vývoj nových HILIC fází s vylepšenou selektivitou a stabilitou při různém pH.

Závěr

Systematický screening stacionárních fází a pH mobilní fáze následovaný cílenou optimalizací gradientu vodné fáze a pufru vedl k robustní HILIC-MS metodě pro separaci 17 volných aminokyselin. Konečná metoda nabízí vyvážené rozlišení, dobré tvary píků a je připravena k validaci a aplikaci v analýze reálných vzorků.

Reference

1. Grumbach E, Fountain K. Comprehensive Guide to HILIC Hydrophilic Interaction Chromatography. Waters Corporation, 2010, pp. 46–47.
2. Walter TH, Alden BA, Berthelette K. Evaluation of the Base Stability of Hydrophilic Interaction Chromatography Columns Packed with Silica or Ethylene-Bridged Hybrid Particles. Separations, 9 (2022) 146.
3. Gilar M, Berthelette K, Walter TH. Contribution of ionic interactions to stationary phase selectivity in hydrophilic interaction chromatography. Journal of Separation Science, 45 (2022) 1–12.
4. Clements B, Rainville P. Improved Chromatographic Analysis of Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs) Using CORTECS Premier Columns That Feature MaxPeak High Performance Surface HPS Technology. Waters Application Note, 720007751, January 2023.
5. Berthelette K, Turner J, Walter TH. Isocratic Separation of RNA Nucleotide Triphosphates Including Pseudouridine using an Atlantis Premier BEH Z-HILIC Column. Waters Application Note, 720007704, August 2022.
6. Layton C, Rainville P. Advantages of Using MaxPeak HPS Technology for the Analysis of Targeted Cancer Growth Inhibitor Therapies. Waters Application Note, 720007565, March 2022.
7. Walter TH, Berthelette K, Patel A, Alden BA, McLaughlin J, Field J, Lawrence N, Shiner S. Introducing Atlantis BEH Z-HILIC: A Zwitterionic Stationary Phase Based on Hybrid Organic/Inorganic Particles. Waters Application Note, 720007311, December 2021.
8. Delano M, Walter TH, Lauber M, Gilar M, Jung MC, Nguyen JM, Boissel C, Patel A, Bates-Harrison A, Wyndham K. Using Hybrid Organic-Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Analytical Chemistry, 93 (2021) 5773–5781.
9. Gritti F, Alden B, McLaughlin J, Walter TH. Retention and mass transfer properties of the series of unbonded, amide-bonded, and alkylsulfobetaine-bonded ethylene bridged hybrid HILIC columns. Journal of Chromatography A, 1692 (2023) 463828.