HPAE-PAD Analysis of N-linked Oligosaccharides from Glycoproteins Using Dual Eluent Generation Cartridge Mode

Význam tématu

Charakterizace N-vázaných oligosacharidů na glykoproteinech je klíčová pro pochopení biologických vlastností terapeutických proteinů, jejich stability, účinnosti a imunogenních aspektů. HPAE-PAD poskytuje citlivou a selektivní techniku pro analýzu složitých sacharidových struktur.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je demonstrovat schopnosti režimu Dual Eluent Generation Cartridge (Dual EGC) na systému Dionex ICS-6000 HPIC pro separaci N-vázaných oligosacharidů uvolněných z glykoproteinů, přičemž se porovnává výkon s tradičními eluenty připravovanými z NaOH/NaOAc.

Použitá metodika a instrumentace

V analýze byl použit Dionex ICS-6000 HPIC systém v kombinaci se dvěma eluentními generátory (EGC 400 MSA a EGC 400 KOH) zapojenými v sérii a kolony CarboPac PA200 (1×250 mm) s guard kolonkou (1×50 mm). Eluent chytré generátory elektrolyticky produkovaly KOH a KMSA bez manuální přípravy. Vzorky imunoglobulinu G byly ošetřeny PNGase F, pro standardy se použily alditoly z fetuinu. Detekce probíhala pulzní amperometrií s kovovou zlatou elektrodou a Ag/AgCl referencí při teplotě 30 °C a průtoku 0,063 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda poskytla srovnatelnou separaci neutrálních i nabitých oligosacharidů lidské IgG jako tradiční systém NaOH/NaOAc, ale výrazně zjednodušuje provoz a zlepšuje přesnost a reprodukovatelnost. Potvrzení přítomnosti Neu5Ac bylo provedeno neuraminidázovou léčbou, která vedla k vymizení píků obsahujících Neu5Ac a vzniku odpovídajících neutrálních sacharidů. Separace fetuinu prokázala ekvivalentní výkon. Retenční časy a plochy píků vykázaly vysokou stabilitu přes tři po sobě jdoucí injekce.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění manuální přípravy eluentu
• Zvýšená reprodukovatelnost a přesnost chromatografie
• Snížená údržba a vyšší dostupnost přístroje
• Vynechání vzorkové derivatizace
• Kompatibilita a ortogonalita vůči CE a HILIC metodám

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace generace eluentů v rámci komplexních glykomických studií, integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní strukturální analýzu, rozšíření do online monitorování výrobních procesů bioterapeutik a adaptace na další třídy sacharidů pro bioprodukci a kvalitu výrobků.

Závěr

Dual EGC režim na systému Dionex ICS-6000 HPIC nabízí robustní, přesnou a efektivní alternativu k manuálně připravovaným eluentům pro HPAE-PAD analýzu N-vázaných oligosacharidů. Zjednodušuje pracovní postupy, eliminuje chyby spojené s přípravou elučního roztoku a zlepšuje reprodukovatelnost výsledků.

Reference

1. Thermo Scientific Technical Note 42: Glycoprotein Oligosaccharide Analysis Using High-Performance Anion-Exchange Chromatography. Sunnyvale, CA. 1997.
2. Rohrer JS, Basumallick L, Hurum DC. Profiling N-linked oligosaccharides from IgG by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. Glycobiology. 2016;582–591.
3. Thermo Scientific Application Note 72714: HPAE-PAD analysis of galactosyl-oligosaccharide containing samples using dual eluent generation cartridges. Sunnyvale, CA. 2018.