Fast Method Development of Salicylic Acid Process Impurities using Agilent ZORBAX Rapid Resolution High Throughput Columns with the Agilent 1200 Series Method Development Solution Controlled by AutoChrom Version 12.01

Význam tématu

Analýza salicylové kyseliny a jejích procesních nečistot je zásadní pro farmaceutický i kosmetický průmysl. Rychlý vývoj chromatografických metod šetří čas, materiál a umožňuje včasnou detekci potenciálně toxických složek. Použití RRHT (Rapid Resolution High Throughput) kolon v kombinaci s automatizovaným návrhem metod ACD/AutoChrom významně zkracuje dobu potřebnou k optimalizaci separace.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou izokratickou metodu pro separaci salicylové kyseliny a pěti vybraných nečistot/metabolitů (4-hydroxybenzoová kyselina, 4-hydroxyisofthalová kyselina, fenol, gentisová kyselina, salicylglycin) v čase pod 3 minuty. K tomu byla využita platforma Agilent 1200 Series Method Development Solution řízená softwarem ACD/AutoChrom verze 12.01, která umožňuje neřízené přepínání mezi třemi RRHT kolónami a šesti mobilními fáze.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická sestava:

• Agilent 1200 Series Method Development Solution: Binary Pump SL (do 600 bar), dva termostatované oddělené komory (TCC), autosampler SL+, detektor DAD
• Solvent selection valve: až 12 různých rozpouštědel, interní čtyřkanálový ventil
• Sloupce Agilent ZORBAX RRHT (4,6×50 mm, 1,8 µm): StableBond SB-C18, Eclipse Plus C18, StableBond SB-Aq
• Mobilní fáze: voda s 0,1% TFA, 0,1% kyselina mravenčí, 0,1% kyselina octová, 10 mM NH4OAc pH 4,8, 10 mM NH4OAc pH 6,5; jako organická fáze acetonitril
• Teplota kolón: konstantních 25 °C, průtok 1,49 mL/min
• Software: Agilent ChemStation B.04.01 SP1, ACD/AutoChrom v12.01, LC Simulator

Hlavní výsledky a diskuse

1) Wave 1 – screening:

• 15 experimentů (3 kolony × 5 modifikátorů) s následným vyhodnocením počtu detekovaných špiček (max. 6) a skóre rozlišení
• Nejlepší kombinace: StableBond SB-C18 a Eclipse Plus C18 s 0,1% TFA (pH ≈2), rozlišení kritické dvojice >3
• Kyselé modifikátory s pH nad 3 způsobovaly špatné rozlišení kvůli interakcím s neukončenými silanolovými skupinami

2) Wave 2 – optimalizace gradientu:

• Testy tří gradientů v čase 3–4 minuty
• Modelování v LC Simulator: konstrukce retenčního modelu a rozlišovací mapy
• Cílový izokratický režim: 15% acetonitrilu / 85% vodné fáze s 0,1% TFA, doba běhu pod 3 min

3) Optimalizace průtoku:

• Průtok 1,5–3,0 mL/min, nejlepší účinnost při 2,5 mL/min (N ≈11 200 destiček)

Přínosy a praktické využití metody

Rychlý vývoj pod-3min izokratické metody přináší významné úspory času a spotřeby rozpouštědel. Metoda je snadno přenositelná na další instrumenty pracující do 1200 bar. Automatizovaný software minimalizuje rutinní úkony operátora a zvyšuje reprodukovatelnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace metody developmentu se očekává rozšířit o využití hmotnostní detekce (LC/MS) pro komplexnější trackování špiček, vylepšené retenční modely a integraci strojového učení pro předpovídání optimálních podmínek. Dalšími oblastmi jsou on-line monitorování a adaptivní řízení kvality v reálném čase.

Závěr

Integrace RRHT kolón a ACD/AutoChrom s Agilent 1200 Series MDS umožnila vyvinout rychlou, robustní a reprodukovatelnou izokratickou metodu pro salicylovou kyselinu a související nečistoty pod 3 minuty. Systém šetří laboratorní zdroje a urychluje rozhodovací proces při vývoji analytických metod.

Reference

• Tatsunari Yoshida, Ronald E. Majors, Hiroki Kumagai. High-Speed Analyses using RRLC on ZORBAX 1.8 µm. Chromatography, 28(2), 2007.
• A. D. Broske et al. The Influence of Sub-Two Micron Particles on HPLC Performance. Agilent Tech. 5989-9251EN, 2003.
• W. J. Long, J. W. Henderson Jr. High-Resolution Analysis of Taxanes Using RRHT Eclipse Plus Phenyl-Hexyl. Agilent Tech. 5989-9340EN, 2008.
• J. W. Henderson Jr., W. J. Long. Exploiting RRHT Columns with Different C18 Selectivities. Agilent Tech. 5989-6128EN, 2007.
• L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. L. Glajch. Practical HPLC Method Development, 2nd ed., Wiley, 1997.
• A. Gratzfeld-Huesgen. An Open-Access LC/MS System Capable of Running Different Applications With up to Eight 1.8 µm Columns. Poster HPLC 2009.
• R. Edam et al. Automated Method Development With Sub-2 µm Particle Columns. Poster HPLC 2009.
• A. Toiu et al. HPLC Analysis of Salicylic Acid Derivatives from Viola Species. Chem. Nat. Comp., 44(3), 2008.
• J. D. Goss. Improved Chromatographic Separation of Salicylic Acid on a Phenyl Column. J Chromatogr A, 828, 1998.
• W. J. Long, J. W. Henderson Jr. Separation of Salicylic Acid Impurities with Different Acid Modifiers. Agilent Tech. 5989-7731EN, 2009.
• USP 23 Salicylic Acid Monograph, 1995.
• B. A. Bidlingmeyer, A. D. Broske. Role of Pore Size in Preventing Aqueous-Induced Retention Time Loss in RPLC. J Chromatogr Sci., 42(2):100–6, 2004.