Agilent LC Method Development Applications Notebook

Význam tématu

Moderní kapalinová chromatografie klade vysoké nároky na rychlé, reprodukovatelné a přenosné analytické metody zejména při využití povrchově porézních částic, které nabízejí účinnost podobnou sub-2 µm sloupkům, ale za výrazně nižšího tlaku. Optimalizace extra-column objemu, volba datových rychlostí, injekčních objemů, vzorkovacích tenzidů a selectivity kolony a mobilní fáze významně zkracuje čas analýzy a spotřebu rozpouštědel.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentovaných aplikací je demonstrovat: automatizované vyhledání optimálních chromatografických podmínek skrze selektivní volbu povrchově porézních fází Poroshell 120 (C18, SB-C18, SB-Aq, Bonus-RP, Phenyl-Hexyl), řízení procesu metodického vývoje pomocí Agilent Method Scouting Wizard, přenos vyvinutých metod mezi UHPLC a HPLC systémy skrze ISET a implementaci Quality by Design přístupu pro robustní a reprodukovatelné analytické metody.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace: Agilent 1290 Infinity LC (Binary Pump, Multisampler, Thermostat, DAD), Agilent 1200 Series LC, Agilent 6140 Single Quadrupole MS. Software: Agilent OpenLAB CDS ChemStation s Method Scouting Wizardem, ISET, Fusion QbD, Waters Empower s ICF. Kolony: Agilent Poroshell 120 EC-C18, SB-C18, SB-Aq, Bonus-RP, Phenyl-Hexyl, HPH-C18. Mobilní fáze: voda/acetonitril/methanol s kyselinovými a pufrovými modifikátory pH 2–10.

Hlavní výsledky a diskuse

Minimalizace extra-column objemu (menší kapiláry, flowcell) vedla ke 30 % až 50 % nárůstu účinnosti sloupců Poroshell 120. Pro správné měření vysokých účinností je nutné datové rychlosti min. 40 Hz. Nižší injekční objemy a méně silné vzorkové rozpouštědlo stabilizují tvar špiček. Optimalizace vzorkovacího pH rozšiřuje schopnost separace ionizovatelných látek. Přenos metod mezi EC-C18 a sub-2 µm C18 ukázal téměř lineární korelaci selektivity s 60 % nižším tlakem. Poroshell HPH-C18 byl stabilní při pH 10 až 2 000 injekcí. Poroshell Bonus-RP a Phenyl-Hexyl demonstrovaly odlišnou selektivitu pro fenoly a aromatické deriváty. Automatizovaný skríning kolony/rozpouštědla/teploty s Method Scouting Wizardem výrazně zrychluje vývoj metod. QbD přístup s Fusion QbD a ISET přenos vede k robustním metodám mezi UHPLC/HPLC.

Přínosy a praktické využití metody

Metody vyvinuté na Poroshell 120 sloupcích vykazují signifikantně kratší analýzy, vyšší rozlišení a robustnost. Automatizovaná tvorba sekvencí pro více kolony a rozpouštědla eliminuje rutinní úkony operátora. ISET emuluje cílové HPLC systémy a umožňuje bezproblémový přenos metod mezi laboratořemi. QbD workflow zvyšuje míru přenositelnosti a plní požadavky regulátorů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj povrchově porézních částic s novými selektivními fázemi, pokročilé mobilní fáze a on-line úpravy pH či iontové síly, využití strojového učení pro návrh chromatografie a plná automatizace analytických workflow rozšíří možnosti kapalinové chromatografie.

Závěr

Povrchově porézní kolony Agilent Poroshell 120 kombinují vysokou účinnost a různorodou selektivitu s nižším tlakem oproti sub-2 µm sloupcům. Automatizovaný vývoj metod s Agilent Method Scouting Wizardem a jejich přenos díky ISET umožňuje rychlý a robustní rozvoj analytických metod, kompatibilních jak s UHPLC tak HPLC infrastrukturovou výbavou.

Reference

1. Long, W.; Mack, A. Maximizing Efficiency Using Agilent Poroshell 120 Columns, Agilent Application Note 5990-5602EN, 2010.
2. Meyer, V.R. Practical High Performance Liquid Chromatography, 4th Ed., Wiley, 2004.
3. Gratzfeld-Hüsgen, A.; Naegele, E. Method Transfer with InfinityLab and ISET, Agilent Technical Overview 5991-6541EN, 2016.
4. Long, W.; Brooks, A. Reduce Tubing Volume to Optimize Column Performance, Agilent Application Note 5990-4964EN, 2009.