Analysis of Polar Compounds Using 100% Aqueous Mobile Phases with Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl and Other ZORBAX Phenyl Columns

Význam tématu

Analytické rozdělení vysoce polárních látek, jako jsou katecholaminy a alifatické kyseliny, představuje v chromatografii významnou výzvu. Tradiční C18 fáze vyžadují nízký podíl organické fáze, často pod 5 %, případně komplikované iontově párovací činidlo, což limituje kompatibilitu s hmotnostní spektrometrií a snižuje reprodukovatelnost. Fenylové stacionární fáze díky odolnosti proti fázovému kolapsu („dewetting“) nabízejí atraktivní alternativu pro 100% vodné mobilní fáze v oborech farmacie, potravinářství i klinické biochemie.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem je demonstrovat schopnost sloupců Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl, Eclipse XDB-Phenyl a StableBond SB-Phenyl separovat polární kyseliny a zásady v čistě vodném eluentu bez fázového kolapsu. Studie porovnává selektivitu tří fenylových fází při různých vodných mobilních fázích (trifluoroctová, mravenčí, octová kyselina, fosfátové pufry) a analyty představují směsi katecholaminů a alifatických kyselin.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit Agilent 1200 Series RRLC systém s binárním čerpadlem, termostatovanou nádobkou, autosamplerem a DAD detektorem (wavelength settings 220–360 nm). Mobilní fáze: 100% voda modifikovaná 0,1–0,2 % TFA, 0,2 % formiát, 1 % octan či 25 mM Na-fosfát pH 2,5–3,0. Kolony: Eclipse Plus Phenyl-Hexyl (4,6×100/150 mm, 3,5–5 μm), Eclipse XDB-Phenyl a StableBond SB-Phenyl (4,6×100/150 mm, 3,5–5 μm). Analyty: směsi keto- a katecholaminů (epinefrin, norepinefrin, dopamin, levodopa, tyrosin) a směsi alifatických kyselin (tartarová, jablečná, mléčná, octová, citrónová, propionová).

Hlavní výsledky a diskuse

• Fenyl-hexyl vs. fenyl-ethyl fáze – srovnatelná selektivita pro katecholaminy v 0,1 % TFA, odlišná retence tyrosinu a impurit.
• Vliv acidifikace – zvýšení TFA z 0,1 na 0,2 % prodlužuje retenci zásad výrazně více než formiát či octan.
• Fosfátové pufry pH 2,5–3,0 – zvýšení retence u zásad oproti octanu, ale méně účinné než TFA.
• Alifatické kyseliny – nejlepší prostorové rozlišení na Eclipse XDB-Phenyl v 25 mM fosfátovém pufru pH 2,5.
• Odolnost proti fázovému kolapsu – Eclipse Plus Phenyl-Hexyl bez změn retence ani tvaru píků i po několika 30minutových pauzách proudu (stop-flow test).

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduché vodné mobilní fáze bez iontově párovacích činidel a nízkého % organiky.
• Vysoká reprodukovatelnost a robustnost díky fenylové chemii odolné vůči dewettingu.
• Kompatibilita s MS detekcí a rychlé úpravy podmínek pro různé typy polárních analytů.
• Uplatnění v QA/QC laboratořích potravin, farmacie a klinické diagnostiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikací na další polární látky (fluorované drogy, aminokyseliny, vitaminy).
• Optimalizace vodných fází pro přímé napojení na hmotnostní spektrometry.
• Vývoj zelené chromatografie se 100% vodou a minimalizovanou chemikálií.
• Systematické srovnání dalších fenylových produktů a jejich modifikací.

Závěr

Agilent ZORBAX fenylové fáze umožňují efektivní separaci polárních kyselin a zásad v čistě vodných mobilních fázích bez fázového kolapsu. Metoda kombinuje jednoduchost přípravy eluentu, flexibilitu selektivity a robustnost provozu, což otevírá nové možnosti v analytické chemii polaritních látek.

Reference

• L. R. Snyder, J. L. Glajch, J. J. Kirkland. Practical HPLC Method Development, 2nd ed., John Wiley & Sons, 1997.
• B. A. Bidlingmeyer, A. D. Broske. The Role of Pore Size and Stationary Phase Composition in Preventing Aqueous-Induced Retention Time Loss in Reversed-Phase HPLC, Journal of Chromatographic Science, 42, 2004.
• Plasma Catecholamines: Their Measurement and Clinical Utility, Lab Med, 30, 512–516.
• Bartek Corporation. Self-Teaching Guide for Food Acidulants, 2007.
• W. Long, J. Henderson. Separation of Salicylic Impurities with Different Acid Mobile Phase Modifiers, Agilent Technologies publication 5989-7731EN, 2008.
• U. D. Neue, K. V. Tran, A. Mendez, P. W. Carr. The Combined Effect of Silanols and the Reversed-Phase Ligand on the Retention of Positively Charged Analytes, Journal of Chromatography A, 1063, 35–45, 2005.
• Handbook of Pharmaceutical Biotechnology, Wiley Interscience, 2007.
• Evaluation of TFA as an Ion Pair Reagent in Separation of Small Molecules by Reversed Phase HPLC, Analytica Chimica Acta, 399(3), 249–258, 1999.