Selectivity nad Particle Size Consideration for High Resolution and High Speed LC

Význam tématu

Vysokorozlišovací kapalinová chromatografie s použitím částic menších než 2 µm přináší výrazné zvýšení účinnosti oddělení. Kromě standardní C18 fáze nabízejí fenylové modifikace odlišnou selektivitu díky π–π interakcím, což umožňuje lepší rozlišení složitých směsí a zefektivnění vývoje chromatografických metod.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo systematicky porovnat vliv různých fenylových a C18 stacionárních fází na selektivitu a rozlišení chromatografického oddělení. Autoři testovali řadu aromatických i alifatických sloučenin, nitro-substituovaných benzenů, NSAID, nukleových bází a komplexní přírodní extrakt z ženšenu za použití sub-2 µm kolonek a tradičních 5 µm fází.

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy probíhaly na kapalinových chromatografech Agilent 1100 a 1200 s detekcí DAD (205–254 nm) a ESI-MSMS.

• Kolonky:
  • ZORBAX RRHT C18 1,8 µm (4,6×50 mm)
  • Eclipse Plus Phenylhexyl, Phenylethyl, Phenylpropyl 5 µm (4,6×100 mm)
  • StableBond C18 a SB-Phenyl 1,8 µm (4,6×50 mm)
• Mobilní fáze:
  • Acetonitril/voda 40:60 až 60:40
  • Metanol/voda 60:40
  • 10–20 mM NH4Acetát pH 4,5–4,7, 25 mM NaH2PO4 pH 2,4
• Parametry:
  • Průtok 1–1,85 mL/min
  • Teplota 30 °C
  • Objem injekce 1–3 µL

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání retention faktorů (k´), účinnosti (N) a selektivity (α) mezi C18 a fenylovými fázemi ukázalo:

• Nitro-substituované aromáty vykazovaly největší rozdíl v retenci na C18 oproti fenylovým kolonám.
• Metanol jako organický modifikátor zvyšuje π–π interakce a tím selektivitu fenylových fází ve srovnání s acetonitrilem.
• Scatter ploty log k´ ilustrovaly změny eluačního pořadí a přeskupení píků pro nukleové báze, NSAID a estrogény.
• Sub-2 µm kolony poskytují až dvojnásobnou účinnost a významné zkrácení analýz proti 150 mm C18 kolonkám.

Přínosy a praktické využití metody

Fenylové fáze se osvědčily jako efektivní třetí volba v metodách, kde C18 nenabízí dostatečnou selektivitu. Hlavní výhody:

• Možnost optimalizace rozlišení aromatických a alifatických směsí či přírodních extraktů.
• Zkrácení doby analýzy o 50–80 % při zachování nebo zvýšení rozlišení.
• Flexibilita vývoje metod díky jednoduché změně stacionární fáze nebo organického modifikátoru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření fenylových kolon s upravenými spacery a endkapací pro širší pH rozsah a kompatibilitu s UHPLC systémy. Integrace s masovou spektrometrií, vývoj hybridních fází kombinujících C18 a aromatické interakce a nasazení zelených rozpouštědel podpoří udržitelnou chromatografii.

Závěr

Studie potvrzuje, že selektivita je klíčovým parametrem pro dosažení optimálního rozlišení. Fenylové stacionární fáze představují ortogonální alternativu k C18 a v kombinaci s částicemi menšími než 2 µm výrazně zvyšují produktivitu analýz. Strategický výběr fáze a organického modifikátoru je nezbytný pro rychlý a efektivní vývoj chromatografických metod.

Reference

1. Long W., Joseph M., Martosella J.D., Henderson J.W. Jr. Phenyl Selectivity Impacts Resolution. Pittcon 2008, New Orleans.
2. Agilent Technologies. Application Note 5989-4506EN: Analysis of a complex natural product extract from ginseng – Part I.