High-throughput analysis with improved proteome coverage using new designed micro pillar array column (μPAC)

Význam tématu

Analýza proteomů pomocí LC-MS je klíčová pro biologický a klinický výzkum. Zlepšení separační části, především kolon, umožňuje vyšší propustnost dat, lepší citlivost a rychlejší analýzu. Nové mikro-pilířkové kolony nabízejí vyšší efektivitu separace při nižším protitlaku, což otvírá cestu k krátkým gradientům a vysokoprodukčním metodám.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a charakterizovat novou µPAC Neo High Throughput kolonu délky 5,5 cm s obdélníkovými pilíři a ověřit její výkon při vysokoprodukční bottom-up proteomice. Porovnání proběhlo s tradičními packed emitter kolony při 180 a 100 vzorcích za den a různém zatížení HeLa digestátu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byl použit standard HeLa digest (200 ng/µl) s příměsí kalibračních PRTC peptidů (100 fmol/µl). Analýzy probíhaly na UHPLC systému Vanquish Neo v přímém injekčním režimu spojeném s Orbitrap Exploris 480 MS v režimu DDA. µPAC Neo High Throughput kolona (5,5 cm) byla ohřána na 50 °C a spájena s EASY-Spray Nano & Capillary emitery (15 nebo 20 µm I.D.). Data byly zpracovány v Proteome Discoverer v3.0 s CHIMERYS a apQuant, FDR nastaveno na 1 % peptidů i proteinů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Úzké šířky peptidových špiček (FWHM <1,5 s) byly dosaženy i při gradientech 5 min a kapilárních průtocích až 2,5 µl/min.
• Při 5min gradientu a průtocích 1–1,5 µl/min kolona identifikovala o 10–30 % více peptidů než packed emitter kolona.
• Dlouhé gradienty (20–30 min) preferují nižší nano-průtoky (300 nl/min) díky lepší separaci a ionizační efektivitě.
• Reprodukovatelnost retenčních časů PRTC peptidů mezi třemi µPAC kolony je <1 % RSD, oproti >1,4 % u packed emitteru.

Přínosy a praktické využití metody

Nová µPAC Neo High Throughput kolona umožňuje rychlé proteomické protokoly (až 180 SPD) bez ztráty rozlišení a citlivosti. Díky nižšímu protitlaku lze uplatnit kapilární průtoky a zkrácené gradienty, což přináší efektivnější časovou a finanční úsporu v prostředí vysoce propustných laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat optimalizaci pilířkové geometri e pro ještě vyšší průtoky, integraci se systémy automatizovaného vzorkování a rozšíření aplikací do klinické biochemie. Kombinace krátkých gradientů s pokročilou datovou akvizicí (DIA, FAIMS) slibuje hlubší pokrytí proteomu během minut.

Závěr

µPAC Neo High Throughput kolona se ukázala jako robustní nástroj pro vysokoprodukční bottom-up proteomiku. Nabízí vylepšenou separační efektivitu, vyšší proteomové pokrytí a vynikající reprodukovatelnost při krátkých gradientech a kapilárních průtocích. Tento přístup významně zrychluje analýzu komplexních vzorků bez kompromisů na kvalitě dat.