Comprehensive analysis of adeno-associated virus quality using 3 μm monodisperse Strong Anion Exchange and Size Exclusion chromatography columns

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) představují klíčové genové vektory díky nízké imunogenicitě a stabilní expresi. Kvalita AAV přípravků závisí na přesném rozlišení prázdných a naplněných kapsid, stanovení titru a vyhodnocení agregátů. Vysoce účinné a reprodukovatelné chromatografické metody tedy zajišťují bezpečnost a účinnost genové terapie.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat robustní a uživatelsky přívětivou analýzu AAV pomocí nových 3 µm monodisperzních kolon Strong Anion Exchange (SAX) a Size Exclusion Chromatography (SEC). Testován byl optimální gradient soli, isokratické fáze a porovnány výkony s konvenčními kolonami.

Použitá metodika a instrumentace

Byl využit UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Flex s fluorescenční detekcí pro SAX analýzu a SEC-MALS měření pomocí SurePac Bio 550 SEC MDi kolony. Rozhraní pro řízení a zpracování dat tvořil Chromeleon 7.2.10, pro MALS analýzu software ASTRA 8.1.2.

Hlavní výsledky a diskuse

Monodisperzní 3 µm částice poskytují vynikající rozlišení prázdných a naplněných kapsid v jednoduchém lineárním gradientu soli. Optimální izokratická fáze při 17 % mobilní fáze B dosahuje baseline separace a asymetrie plné kapsidy blízké 1,0. SEC-MALS analýza zkrátila dobu běhu na polovinu oproti konvenční koloně a zároveň zdvojnásobila počet desek, čímž zlepšila definici agregátů (dimer, trimer) a umožnila přesnější stanovení molekulové hmotnosti.

Přínosy a praktické využití metody

Výsledná metoda nabízí:

• Vysokou reprodukovatelnost sloupce a šarží
• Rychlejší analýzu a nižší spotřebu vzorku
• Výrazně lepší rozlišení agregátů i kapsid
• Možnost kvantitativního sledování prázdných vs. plných částic

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace s dalšími orthogonálními technikami (AUC, cryo-EM) pro kalibraci fluorescenčních signálů a přesné kvantifikace. Další vývoj by mohl zahrnovat rozšíření metodiky na jiné serotypy AAV, optimalizaci gradientů a vývoj nových povrchových modifikací stacionární fáze.

Závěr

3 µm monodisperzní SAX a SEC kolony představují významný pokrok v kvalitativní i kvantitativní analýze AAV. Nabízejí robustnost, vysoké rozlišení a zrychlený provoz, což podporuje standardizaci metod pro genovou terapii.

Reference

• Wang C., Mulagapati S.H.S., Chen Z. et al. Developing an Anion Exchange Chromatography Assay for Determining Empty and Full Capsid Contents in AAV6. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2019, 15, 257–263.
• Aebischer M.K., Gizardin-Fredon H., Lardeux H. et al. Anion-Exchange Chromatography at the Service of Gene Therapy: Baseline Separation of Full/Empty Adeno-Associated Virus Capsid by Screening of Conditions and Step Gradient Elution Mode. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23(20), 12332.
• Khatwani S.L., Pavlova A., Pirot-Zhu et al. Anion-exchange HPLC assay for separation and quantification of empty and full capsid in multiple adeno-associated virus serotypes. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2021, 21, 548–558.