Semi-preparative reversed-phase liquid chromatographic purification of oligonucleotides

Význam tématu

Oligonukleotidy se staly základním nástrojem v molekulární diagnostice, farmaceutickém výzkumu a forenzní identifikaci. Precizní purifikace oligonukleotidů je nezbytná pro odstranění syntetických nečistot, zajištění reprodukovatelnosti kvantitativních polymerázových testů a splnění přísných standardů kvality u biotechnologických a léčebných aplikací.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo demonstrovat semi-preparativní reverzně-fázovou HPLC purifikaci tří dualně značených 25m oligonukleotidů využívaných v qPCR, forenzních HID protokolech a gene transfer agentech. Studie popisuje optimalizaci gradientu, podmínek detekce a frakcionace k odstranění vedlejších produktů syntézy při zachování cílové sloučeniny.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byl využit gradient triethylamonného octanu (TEAA) a acetonitrilu na kolóně C18 (Waters Xbridge BEH C18 OBD Prep). Pracovní podmínky zahrnovaly:

• Flow rate 5,0 mL/min při teplotě 60 °C
• Mobile phase A – 50 mM TEAA pH 7,0 s 5 % acetonitrilu
• Mobile phase B – čistý acetonitril
• Gradient od 100 % A do 95 % B s návratem na 100 % A
• Detekce UV při 260 nm, šířka pásma 4 nm
• Frakcionátor s přesností na 0,5 RT, kapacita tubusů 1,6 mL

Instrumentace:

• Vanquish Flex Analytical Purification LC systém
• Vanquish Binary Pump F
• Vanquish Split Sampler FT se smyčkou 1000 µL
• Vanquish Column Compartment H s předehřevem
• Vanquish Diode Array Detector FG
• Integral Vanquish Fraction Collector

Hlavní výsledky a diskuse

Při počáteční analýze měly vzorky čistoty mezi 89 a 93 %. Po semi-preparativní purifikaci a následné reanalýze frakcí byla dosažena 100% relativní čistota všech tří oligonukleotidů. Izolace byla přesná s oddělením menších nečistot a ramének v chromatogramu. Diskutována je rovněž chromatografická neseparatibilita isomerů barviv, která však pro aplikaci nebyla kritická a byla zachycena v jedné frakci.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vyšší rozlišení a reprodukovatelnost oproti běžné semi-preparativní technice
• Automatizovaný workflow s krátkým časem přípravy
• Možnost rychlé produkce vysoce čistých oligonukleotidů pro farmaceutické a forenzní laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se očekává v oblasti novelních stacionárních fází pro lepší separaci sekvenčně podobných produktů, integrace s hmotnostní spektrometrií pro okamžitou identifikaci frakcí a miniaturizace celého systému za účelem vyšší propustnosti. Rozšíření automatizovaných online monitorovacích metod pak umožní real-time kontrolu purifikace.

Závěr

Použití integrovaného Vanquish Flex Analytical Purification LC systému s Chromeleon CDS pro semi-preparativní RP-HPLC prokázalo vynikající účinnost oddělení oligonukleotidů od nežádoucích produktů syntézy. Metoda poskytuje vysokou čistotu a automatizaci potřebnou pro moderní biochemickou a farmaceutickou praxi.

Reference

• Roberts T., Langer R., Wood M. 2020. Nature Reviews Drug Discovery, 19, 673–694.
• Zhang Q., Lü W. 2016. International Journal of Molecular Sciences, 17(12), 2134.
• Catani M. et al. 2020. Biotechnology Journal, 15(8), 1900226.
• Kanwal F. et al. 2018. Cellular Physiology and Biochemistry, 1915–1927.
• Cramer H., Finn K., Herzberg E. 2011. CRC Press.
• Vanquish fraction collection principles, Thermo Fisher Scientific technical note.