Efficient Method Development of Small Interfering RNA by Reversed-Phase Ion-Pair Chromatograph

Význam tématu

Small interfering RNA (siRNA) představuje slibný prostředek pro řízení genové exprese a potlačení nežádoucích proteinů. Pro vývoj a kontrolu kvality oligonukleotidových léčiv je klíčová přesná separace sense a antisense vlákna i souvisejících nečistot. Ion-pair reverzní fázová chromatografie (IP-RP LC) za denaturačních podmínek je standardní technikou, jejíž optimalizace je náročná na volbu parametrů, jako je složení mobilní fáze, typ kolony či teplota.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout efektivní workflow pro rychlou a spolehlivou metodiku separace siRNA a jejích nečistot. Autoři využili softwarový nástroj LabSolutions MD pro podporu vývoje metod a systém Nexera XS inert se speciálními biokompatibilními kolonkami Shim-pack Scepter Claris.

Použitá metodika a instrumentace

V metodě byla aplikována IP-RP LC s mobilní fází obsahující 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) a třetí aminy (DIPEA). Proti gradientu metanol/voda (0,3 mL/min) byly testovány různé koncentrace HFIP (100 a 200 mmol/L) a DIPEA (2, 5, 10, 20 %), teploty kolony (45, 55, 65 °C) a tři stacionární fáze (C18 s póry 12 nm, C18 s póry 30 nm, C4 s póry 30 nm).

Použitá instrumentace

• Nexera XS inert (Shimadzu) – systém pro scouting metod
• Kolony Shim-pack Scepter Claris C18-120, C18-300 a C4-300 (100 × 2,1 mm I.D., 3 µm)
• Detekce UV při 260 nm (SPD-M40, UHPLC inert cell)

Hlavní výsledky a diskuse

Testy různých alkylaminů prokázaly, že N,N-diisopropylethylamin (DIPEA) poskytuje nejlepší kompromis mezi rozlišením sense/antisense a nečistot. Nižší koncentrace HFIP osvětlily mírný vliv na separaci, optimální byla 200 mmol/L. Optimalizace pomocí design space analýzy ukázala, že vyšší teplota kolony (65 °C) a DIPEA kolem 10 % maximalizují rozlišení. LabSolutions MD automaticky identifikovalo bod s nejlepšími parametry (kombinace koncentrace DIPEA, teploty a typu kolony), bez nutnosti rozsáhlých manuálních úprav.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace integrovaného softwaru pro vývoj metod výrazně zkracuje čas potřebný pro screening a vyhodnocení výsledků. Navržená metoda umožňuje spolehlivou charakterizaci siRNA v laboratorním i průmyslovém prostředí, zlepšuje reprodukovatelnost a podporuje validaci QC procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na další oligonukleotidové formy (miRNA, ASO)
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní identifikaci fragmentů
• Využití umělé inteligence pro pokročilejší návrh design spaces a predikci separací
• Automatizace přípravy vzorků a on-line systémů pro vysokopropustné screeningy

Závěr

Studie demonstrovala, že kombinace inertního chromatografického systému, vhodně zvolené mobilní fáze a softwarového nástroje LabSolutions MD umožňuje rychlý a cílený vývoj optimalizované metody pro separaci siRNA a jejích nečistot. Navržený přístup zjednodušuje vývoj a zvyšuje spolehlivost analýz.

Reference

• Sean M. McCarthy, Martin Gilar, John Gebler; Analytical Biochemistry, Volume 390, Issue 2, 15 July 2009, Pages 181-188