Efficient Method Development of Oligonucleotides by Reversed-Phase Ion-Pair Chromatography

Význam tématu

Antisenseové oligonukleotidy a další nukleové kyseliny využívané jako léčiva vyžadují spolehlivou separaci pro zajištění kvality, identifikaci nečistot a kvantifikaci jednotlivých komponent. Reverzně-fázová iontově párvací chromatografie (RP-IP) je klíčovým nástrojem pro analýzu těchto polárních biomolekul, ale vyžaduje cílenou optimalizaci parametrů mobilní fáze, teploty a gradientu pro každou sekvenci.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje efektivní vývoj metody separace modelového antisense oligonukleotidu a pěti souvisejících nečistot pomocí softwaru LabSolutions MD. Hlavními kroky jsou počáteční screening mobilních fází, detailní optimalizace chromatografických podmínek a automatizované vyhodnocení výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda RP-IP chromatografie byla prováděna na UHPLC systému Nexera XS inert se sloupcem Shim-pack Scepter Claris (100×2,1 mm, 3 µm). Mobilní fáze obsahovala HFIP a triethylamin v různých koncentracích kombinovaných s acetonitrilem a methanolem v gradientu. Chromatografická separace probíhala při teplotách 55–65 °C a toku 0,4 mL/min. Detekce UV při 260 nm byla doplněna hmotnostní spektrometrií (LCMS-2050, ESI/APCI, negativní mód).

Hlavní výsledky a diskuse

Počáteční screening 24 kombinací HFIP (100 vs. 200 mmol/L), TEA (5–20 mmol/L) a poměru acetonitril/methanol odhalil optimální podmínku 100 mmol/L HFIP, 10 mmol/L TEA a 50 % acetonitrilu s nejvyšší souhrnnou hodnotou rozlišení. Následná optimalizace gradientu, počáteční koncentrace organiky a teploty ukázala, že vyšší podíl organiky a vyšší teplota zlepšují rozlišení kritických párů píků. Automatizovaná evaluace pomocí LabSolutions MD a LCMS-2050 umožnila přesnou identifikaci i u sloučenin se velmi podobnými UV spektry díky sledování molekulové hmotnosti.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá tvorba a vyhodnocení rozsáhlých analytických plánů díky automatizaci softwaru LabSolutions MD.
• Snížení chyb spojených s manuální přípravou mobilních fází a ručním sledováním píků.
• Přesná identifikace a kvantifikace nečistot u strukturálně podobných oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace AQbD přístupu a využití softwarové podpory pro návrh design spaces otevírá možnosti pro robustnější, přenositelné a validovatelné metody v biofarmaceutickém výzkumu. V budoucnu lze očekávat rozšíření o strojové učení pro predikci optimálních podmínek a aplikaci na další třídy nukleových kyselin včetně RNA terapeutik.

Závěr

Kombinace softwaru LabSolutions MD, UHPLC Nexera XS inert, kolony Shim-pack Scepter Claris a LCMS-2050 představuje efektivní, plně automatizované řešení pro vývoj RP-IP metod oligonukleotidů. Systém umožňuje rychlý screening, cílenou optimalizaci a jednoznačnou identifikaci píků, což výrazně zefektivňuje analytické workflow.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém: Nexera™ XS inert
• Kolona: Shim-pack Scepter™ Claris (100 mm×2,1 mm, 3 µm, inertní povrch)
• Hmotnostní spektrometrie: LCMS-2050 (ESI/APCI, negativní mód)