Efficient Method Development of Oligonucleotides by Reversed-Phase Ion-Pair Chromatograph

Význam tématu

Oddělení cílového oligonukleotidu od nežádoucích kratších či delších produktů a ochranných skupin je zásadní pro zajištění kvality a bezpečnosti léčiv na bázi nukleových kyselin.

• Umožňuje přesné kvantitativní i kvalitativní hodnocení finálního produktu (FLP) a vedlejších nečistot.
• Liquid chromatography s reverzní fází a ion-pair reagenty je standardní technikou pro tento účel.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout systematickou a rychlou metodu pro optimalizaci chromatografických podmínek separace oligonukleotidů s využitím softwarového nástroje LabSolutions MD podle přístupu Quality by Design.

• Provést široké screeningové testy mobilní fáze.
• Vyhodnotit robustnost metody pomocí návrhu prostorů podmínek (design space).
• Maximalizovat počet detekovaných píků a jejich rozlišení.

Použitá metodika a instrumentace

Studie zahrnovala reverzní fázi s ion-pair chromatografií a kvantitativní hodnocení separace pomocí nasledujícího vybavení:

• Nexera XS inert Method Scouting System s kolonkou Shim-pack Scepter Claris (100 mm × 2,1 mm, 3 µm).
• Mobilní fáze s proměnnými koncentracemi 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanolu (HFIP), triethylaminu (TEA) a organických komponent (ACN/MeOH).
• LCMS-2050 (jednočtvrpolový hmotový spektrometr) pro přesné sledování píků metodou ESI v negativním režimu.
• Detekce při 260 nm fotodiode array detektorem s inertní UHPLC cely.

Hlavní výsledky a diskuse

Po úvodním screeningu se jako klíčové parametry ukázaly koncentrace HFIP a TEA v mobilní fázi a poměr acetonitrilu k methanolu:

• Hodnota Evaluation Value (počet píků × součet rozlišení) nejlépe vyšla pro 100 mmol/L HFIP, 10 mmol/L TEA a 50 % acetonitrilu.
• Návrh prostorů podmínek ukázal, že vyšší teplota kolony (až 65 °C) zlepšuje rozlišení píků.
• Optimální gradient začínal na 8 % organické fáze, s konečným poměrem ACN cca 54 % a teplotou kolony 65 °C, což splnilo kritéria rozlišení (Rs(n-1(3’)/PO) > 0,7) a celkového času retence (< 16 min).
• Perfektní oddělení mezi píkami n-1(5’) a n-1(3’) nebylo dosaženo kvůli podobné struktuře, metoda ale maximalizovala jejich vzájemné rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný přístup přináší řadu výhod:

• Výrazné zkrácení času pro vývoj analytické metody.
• Minimalizace ruční práce při vyhodnocování chromatogramů.
• Zvýšení kvality a reprodukovatelnosti dat v QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze dále rozšířit a zdokonalit:

• Integrace strojového učení pro predikci optimálních podmínek.
• Aplikace na modifikované oligonukleotidy a širší třídy biopolymerů.
• Propojení s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie a online QC procesy.
• Využití alternativních zelených organických rozpouštědel.

Závěr

Automatizované algoritmické vyhledávání nejlepších chromatografických podmínek pomocí LabSolutions MD a konceptu design space umožňuje rychlou, robustní a vysoce reprodukovatelnou separaci oligonukleotidů, což urychluje vývoj a kontrolu kvality nukleových léčiv.

Reference

Shin-ichi Fujisaki, Risa Suzuki, Kyoko Watanabe, Junji Kawakami, Takao Inoue, Satoshi Obika. Efficient Method Development of Oligonucleotides by Reversed-Phase Ion-Pair Chromatography, P-BPHA13.