2D-LC/MS Characterization of Charge Variants Using Ion Exchange and Reversed-Phase Chromatography

Význam tématu

Analýza variant náboje (charge variants) monoklonálních protilátek (mAbs) je klíčovým krokem v jejich vývoji a kontrole kvality. Tyto varianty, vznikající posttranslačními modifikacemi, ovlivňují účinnost, stabilitu a bezpečnost biofarmaceutik. S nástupem biosimilárních produktů je přesné rozlišení a charakterizace inovátoru vůči biosimiláru zásadní pro prokázání ekvivalence a zajištění kvality.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat profil nábojových variant Rituximabu inovátora a jeho biosimiláru pomocí dvourozměrné LC/MS metody. První dimenze (IEX) testovala tři různé gradienty (dva solné, jeden pH), zatímco druhá dimenze (RP) sloužila k automatickému odsolení a denaturaci pro online MS detekci pomocí Q-TOF.

Použitá metodika a instrumentace

1D IEX separace:

• Ion exchange: WCX kolona Agilent Bio mAb (2.1×250 mm, 5 µm)
• Gradienty: 1) solný v fosfátovém pufru (pH 6.2), 2) pH gradient (6.8→8.2), 3) solný v 10 mM amonném formiátu (pH 6.2)

2D RP desalting:

• RP kolona AdvanceBio RP-mAb C4 (2.1×75 mm, 3.5 µm)
• Mobilní fáze: kyselá voda (5 % FA)/acetonitril (5 % FA)
• Režim multiple heart-cutting s 12 smyčkami po 40 µL

MS detekce:

• Agilent 6530 Accurate Mass Q-TOF
• Parametry: ESI, referenční hmota 1 821.9523 Da, teplota zdroje 300–400 °C

Řídicí software:

• Agilent OpenLab CDS, 2D-LC Acquisition, MassHunter Workstation

Hlavní výsledky a diskuse

• Nejvyšší reprodukovatelnost retenčních časů pro fosfát/NaCl systém, nejvyšší rozlišení pro pH gradient a nejlepší kompromis pro amonný formiát.
• Inovátor vykazoval jeden hlavní nábojový štěp, biosimilár obsahoval tři významné hlavní vrcholy.
• Deconvoluce MS spectrum odhalila, že první biosimilární vrchol G0F/G0F má shodnou hmotnost s inovátorem, další dva vrcholy jsou C-koncové varianty navíc obsahující jednu či dvě zbytky lysinu (+128 Da).
• RP druhá dimenze efektivně odstraňovala pufr, umožnila rychlou intenzivní denaturaci a přímou Q-TOF analýzu.
• Použití časového plánu pro MS diverter ventil zabránilo kontaminaci zdrojových částí solnými pufry; bez tohoto režimu se na zdroji hromadily inkrustace.

Přínosy a praktické využití metody

• Online LC/MS workflow bez manuálních zásahů: automatické odsolení a denaturace ve 2. dimenzi.
• Rychlá identifikace a kvantifikace variant náboje monoklonálních protilátek.
• Vysoká flexibilita: zachování stávajících IEX metod, MS kompatibilita zásluhou volatile pufrů a heart-cuttingu.
• Vhodné pro development a QA/QC v biotechnologickém i farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na komplexní glykoformy a další PTM pomocí hybridních MS technik (native MS, IM-MS).
• Automatizované platformy 3D-LC/MS s vyšší úrovní orthogonalit volených separačních principů.
• Integrace s datovými analýzami strojového učení pro predikci kvality proteinů a zrychlení rozhodování ve vývoji.
• Adaptace metody pro jiné typy bioterapeutik (Fc fragmenty, fúzní proteiny, ADC).

Závěr

Dvourozměrná kombinace IEX (multiple heart-cutting) a RP s online Q-TOF MS detekcí poskytuje robustní a vysoce informativní platformu pro charakterizaci nábojových variant mAbs. Workflow zajišťuje přesnou identifikaci glykovariant a C-koncových modifikací, efektivní desalting a denaturaci pro přímou MS analýzu a minimalizuje riziko kontaminace MS zdroje.

Reference

1. Hongwei X. Rapid comparison of a candidate biosimilar to an innovator monoclonal antibody with advanced liquid chromatography and mass spectrometry technologies. MAbs. 2010;2(4):379–394.
2. Coffey A. pH Gradient Elution for Improved Separation of Monoclonal Antibody Charge Variants. Agilent Technologies Application Note. 2013;5990-9629EN.
3. Schneider S. Simple Method Optimization in mAb Charge Variant Analysis Using pH Gradients Generated from Buffer Advisor with Online pH and Conductivity Monitoring. Agilent Technologies Application Note. 2013;5991-3365EN.
4. Thierry LB, et al. On-line strong cation exchange μ-HPLC-ESI-MS/MS for protein identification and process optimization. J Am Soc Mass Spectrom. 2003;14(7):719–727.
5. Van Duijn E. Current Limitations in Native Mass Spectrometry Based Structural Biology. J Am Soc Mass Spectrom. 2010;21(6):971–978.
6. Buckenmaier S. Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution for Multiple Heart-Cutting. Agilent Technologies Application Note. 2015;5991-5615EN.
7. Krieger S. Application of Multiple Heart-Cutting 2D-LC in Method Development for Impurity Analysis – The Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution. Agilent Technologies Application Note. 2015;5991-5643EN.
8. Lawrence WD Jr. C-Terminal Lysine Variants in Fully Human Monoclonal Antibodies: Investigation of Test Methods and Possible Causes. Biotechnol Bioeng. 2008;100(6):1132–1143.