HPAE-PAD Determination of Infant Formula Sialic Acids

Význam tématu

Dietární sialové kyseliny hrají klíčovou roli ve vývoji imunitního i kognitivního systému kojenců. Přirozeně se vyskytují v mateřském mléce a jsou součástí oligosacharidů, glykoproteinů a glykolipidů. Běžné kojenecké formule na bázi kravského mléka mají nižší obsah sialových kyselin než lidské mléko, a proto jsou obohacovány o tyto látky, aby se co nejvíce přiblížily složení mateřského mléka.

Cíle a přehled studie

• Vyvinout a optimalizovat analytickou metodu pro kvantifikaci N-acetylneuraminové (Neu5Ac) a N-glykolylneuraminové (Neu5Gc) kyseliny v práškových kojeneckých formulích.
• Porovnat dva způsoby přípravy vzorku po kyselém hydrolýze: iontově-výměnnou očistu (OnGuard IIA) a enzymatickou digestii maltodextrinů (amyloglukosidáza).
• Využít chromatografii HPAE-PAD s kolonkou CarboPac PA20 pro přímou detekci bez nutnosti derivatizace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky formulí byly nejprve suspenzovány ve vodě a hydrolyzovány 50 mM kyselinou sírovou při 80 °C po dobu 1 h. Následovalo odstranění interferujících sacharidů dvěma způsoby:

• Iontově-výměnná analýza: OnGuard IIA kartridže konvertované na chloridovou formu, vazba sialových kyselin, eluce 50 mM NaCl a ředění.
• Enzymatická digestie: přídavek amyloglukosidázy přímo do hydrolyzátu při pH 3, inkubace 1 h při pokojové teplotě.

Instrumentace:

• Dionex ICS-3000 HPAE-PAD systém s CarboPac PA20 kolonkou (3×150 mm) a PA20 guard (3×30 mm).
• Pulsní amperometrický detektor s jednorázovou zlatou elektrodou a Ag/AgCl referenční elektrodou.
• Eluční gradient: 10–200 mM acetát v 100 mM NaOH (0–15 min), 200 mM acetát (15–20 min), návrat na 10 mM (20–25 min); průtok 0,5 mL/min; teplota 30 °C; injekční objem 10 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykázala vysokou linearitu (r2 > 0,9995) pro rozsahy 1–75 pmol Neu5Ac a 0,34–6,8 pmol Neu5Gc. LOD/LOQ byly stanovena na 0,24/0,80 pmol pro Neu5Ac a 0,21/0,70 pmol pro Neu5Gc. Retenční časy měly RSD ≤ 0,05 % a area RSD ≤ 2 % (Neu5Ac) resp. ≤ 2 % (Neu5Gc).
Ion-exchange příprava vzorku zajistila snadné oddělení Neu5Ac od sacharidových rušivých složek, recovery 80–109 % pro Neu5Ac a 78–111 % pro Neu5Gc. Metoda enzymatické digestie úspěšně odstraňovala maltodextriny v mléčných formulích, avšak u sójových vzorků s alternativními polysacharidy byla účinnost nižší (recovery 80–95 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Directní analýza bez nutnosti derivatizace šetří čas a snižuje chybovost.
• Vysoká selektivita a citlivost HPAE-PAD pro monitorování Neu5Ac a Neu5Gc.
• Metoda vhodná pro rutinní kontroly kvality kojeneckých formulí obohacených o sialové kyseliny.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace přípravy vzorku pro široké spektrum složení formulí (různé sacharidové přísady).
• Automatizace procesů hydrolýzy a očisty pro vyšší throughput v průmyslových laboratořích.
• Rozšíření metody na stanovení dalších derivátů neuraminových kyselin v biologických vzorcích.

Závěr

Vyvinutá HPAE-PAD metoda s CarboPac PA20 kolonkou a přímou detekcí sialových kyselin prokázala vysokou citlivost, přesnost a opakovatelnost. Dva přístupy přípravy vzorku (iontově-výměnná částice a enzymatická digestie) poskytují flexibilitu při odstranění interferujících sacharidů v různých typech kojeneckých formulí. Metoda je vhodná pro rutinní analýzu a kontrolu kvality obohacování kojeneckých výrobků.

Reference

1. Wang B., Brand-Miller J. The Role and Potential of Sialic Acid in Human Nutrition. European Journal of Clinical Nutrition. 2003, 57, 1351–1369.
2. Wang B., Brand-Miller J., McVeigh P., Petocz P. Concentration and Distribution of Sialic Acid in Human Milk and Infant Formulas. American Journal of Clinical Nutrition. 2001, 74, 510–515.
3. Lacombe R. et al. Determination of Sialic Acid and Gangliosides in Biological Samples and Dairy Products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2010, 51, 346–357.
4. Rohrer J.S. Analyzing Sialic Acids Using High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection. Analytical Biochemistry. 2000, 283, 3–9.
5. Dionex Corporation. Improved Long-Term Stability of N-Acetylneuraminic Acid and N-Glycolylneuraminic Acid Peak Area Responses Using Waveform A. Application Update 141, LPN 125, 2000.
6. Dionex Corporation. Eluent Preparation for High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection. Technical Note 71, LPN 1932-01, 2007.
7. Dionex Corporation. Product Manual: OnGuard II Cartridges. Document No. 031688-06, 2004.
8. Martín M.J., Vázquez E., Rueda R. Application of a Sensitive Fluorometric HPLC Assay to Determine the Sialic Acid Content of Infant Formulas. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2007, 387, 2943–2949.
9. Oh J., Kim J. Preparation and Properties of Immobilized Amyloglucosidase on Nonporous PS/PNaSS Microspheres. Enzyme and Microbial Technology. 2000, 27, 356–361.