Direct Determination of Sialic Acids in Glycoprotein Hydrolyzates by HPAE-PAD

Význam tématu

Sialické kyseliny představují klíčovou složku glykoproteinů, která ovlivňuje jejich biologickou aktivitu, farmakokinetiku, stabilitu i případnou imunitní reakci. Rozdíl mezi formami N-acetylneuraminové (Neu5Ac) a N-glykolylneuraminové (Neu5Gc) kyseliny je zásadní, protože přítomnost Neu5Gc v léčivých proteinech může vyvolat protilátkovou odpověď u člověka, který Neu5Gc sám nevytváří.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a validovat rychlou, citlivou a přímou metodu stanovení Neu5Ac a Neu5Gc v glykoproteinových hydrolyzátech bez nutnosti chemické derivatizace. Metodu vysokotlaké aniontové výměnné chromatografie s pulzní amperometrickou detekcí (HPAE-PAD) na kolóně CarboPac PA20 autoři aplikovali na pět modelových glykoproteinů a porovnali kyselinovou hydrolýzu s enzymatickou digescí neuraminidázou.

Použitá metodika

• Kyselinová hydrolýza: štěpení proteinů v 2 M octové kyselině po dobu 2 h za mírných podmínek, následné lyofilizace a rozpuštění ve vodě.
• Enzymatická digesce: inkubace glykoproteinů s 1 mU/mL neuraminidázy při 37 °C po dobu 18 h, poté ředění vzorku.
• Chromatografie: gradient 70–300 mM octanu v 100 mM NaOH na kolóně CarboPac PA20 (3×150 mm) s strážní kolónou (3×30 mm); průtok 0,5 mL/min, teplota 30 °C, celková doba analýzy 16,5 min.
• Detekce: pulzní amperometrie s použitím jednorázové zlato/PTFE pracovní elektrody.

Použitá instrumentace

• Ion chromatograf Dionex ICS-3000/5000 se SP/DP pumpou, DC modulem a AS autosamplerem
• Elektrochemický detektor (ED) s Au/PTFE jednorázovou elektrodou a Ag/AgCl referencí
• Kolóna CarboPac PA20 a CarboPac PA20 Guard
• Software Chromeleon 7
• Lyofilizátor, blokový ohřívač, nylonové filtry, mikrocentrifugové zkumavky a další základní spotřební materiál.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární rozsah a citlivost: Neu5Ac 1–100 pmol (r2=0,9997), Neu5Gc 0,39–7,8 pmol (r2=0,9995); LOD 0,17 pmol Neu5Ac a 0,08 pmol Neu5Gc, LOQ 0,5 pmol a 0,3 pmol.
• Preciznost: RSD retence <0,2 %, RSD plochy <3 %.
• Analýza pěti glykoproteinů: u lidských transferrinů a α1-kyselých glykoproteinů Neu5Gc nedetekováno, u hovězího fetuinu a apo-transferrinu přítomno.
• Mezi-denní preciznost (3 dny) 7,9–14 % RSD, intradení 1,7–22 % RSD.
• Recovery testy pro stanovení vzorkové přípravy: 75–86 % po lyofilizaci, 76–102 % při přímém ředění.
• Stabilita hydrolyzátů po 14 dnech při –40 °C: změny hodnot do 15 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Přímá analýza bez derivatizace značně zkracuje čas přípravy a eliminuje riziko kontaminace.
• Doba analýzy 16,5 min je o 40 % kratší než dřívější metody, nižší spotřeba eluenta a redukce odpadu zvyšují propustnost.
• Jednorázová Au/PTFE elektroda s životností čtyři týdny minimalizuje údržbu systému.
• Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu jakosti terapeutických proteinů i výzkumné laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace kyselinové hydrolýzy pro maximální uvolnění sialických kyselin bez degradace.
• Aplikace na širší spektrum glykokonjugátů a vyhodnocení O-acetylovaných forem.
• Integrace s automatizovanými vyztuženými systémy pro vysokopropustné analýzy.
• Kombinace s hmotnostní spektrometrií pro strukturální charakterizaci s vyšší selektivitou.
• Využití v klinické diagnostice a biopharma QA/QC pro detekci strukturálních modifikací glykoproteinů.

Závěr

Vyvinutá metoda HPAE-PAD na kolóně CarboPac PA20 umožňuje rychlé, citlivé a přímé stanovení Neu5Ac a Neu5Gc bez nutnosti derivatizace. Vysoká přesnost, opakovatelnost a snadná údržba systému dělají metodu atraktivní pro rutinní i výzkumné aplikace v oblasti analytické chemie glykoproteinů.

Reference

1. Byrne B.; Donohoe G.G.; O’Kennedy R. Sialic Acids: Carbohydrate Moieties that Influence the Biological and Physical Properties of Biopharmaceutical Proteins and Living Cells. Drug Discovery Today 2007;12:319–326.
2. Angata T.; Varki A. Chemical Diversity in the Sialic Acids and Related α-Keto Acids: An Evolutionary Perspective. Chem Rev 2004;102:439–469.
3. Padler-Karavani V.; Yu H.; Cao H.; Chokhawala H.; Karp F.; Varki N.; Chen X.; Varki A. Diversity in Specificity, Abundance, and Composition of Anti-Neu5Gc Antibodies in Normal Humans. Glycobiology 2008;18:818–830.
4. Lacombe R.; Salcedo J.; Algeria A.; Lagarda M.J.; Barbera R.; Mantencio E. Determination of Sialic Acid and Gangliosides in Biological Samples and Dairy Products. J Pharm Biomed Anal 2010;51:346–357.
5. Rohrer J.S. Analyzing Sialic Acids Using High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection. Anal Biochem 2000;283:3–9.
6. Dionex Corporation. Application Update 141: Improved Long-Term Stability of N-Acetylneuraminic Acid. LPN 125, 2000.
7. Dionex Corporation. Technical Note 41: Analysis of Sialic Acids Using HPAE-PAD. LPN 0931-02, 2000.
8. Dionex Corporation. Technical Note 71: Eluent Preparation for HPAE-PAD. LPN 1932-01, 2007.
9. Varki A.; Diaz S. The Release and Purification of Sialic Acids from Glycoconjugates: Methods to Minimize the Loss and Migration of O-Acetyl Groups. Anal Biochem 1984;137:236–247.
10. Dionex Corporation. Application Note 278: UHPLC Determination of Sialic Acids with Fluorescence Detection. LPN 2817, 2011.
11. Fan J.Q.; Namiki Y.; Matsuoka K.; Lee Y.C. Comparison of Acid Hydrolytic Conditions for Asn-linked Oligosaccharides. Anal Biochem 1994;219:375–378.
12. Spiro R.G.; Bhoyroo V.D. Structure of the O-glycosidically Linked Carbohydrate Units of Fetuin. J Biol Chem 1974;249:5704–5717.
13. Townsend R.R.; Hardy M.R.; Cumming D.A.; Carver J.P.; Bendiak B. Separation of Branched Sialylated Oligosaccharides Using High-pH Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection. Anal Biochem 1989;182:1–8.
14. Richardson N.E.; Buttress N.; Feinstein A.; Stratil A.; Spooner R.L. Structural Studies on Individual Components of Bovine Transferrin. Biochem J 1973;135:87–92.
15. Spik G.; Bayard B.; Fournet B.; Strecker G.; Bouquelet S.; Montreuil J. Studies on Glycoconjugates. LXIV. Complete Structure of Two Carbohydrate Units of Human Serotransferrin. FEBS Lett 1975;50:296–299.
16. Friedrich M.; Berger E.G. Effect of Neuraminidase Treatment of IgG and Alpha 1-Acid Glycoprotein on Their Intestinal Transport in Suckling Rats in Vivo. J Pediatr Gastroent Nutr 1982;1:395–399.