Rapid Screening of Sialic Acids in Glycoproteins by HPAE-PAD

Význam tématu

Glykozylace a zejména sialylace glykoproteinů ovlivňuje stabilitu, bio-dostupnost a imunogenicitu léčivých proteinů. Přítomnost Neu5Gc v terapeutických glykoproteinech může vyvolat imunitní reakci, proto je klíčové přesně a rychle stanovit obsah Neu5Ac a Neu5Gc.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou, přímou metodu pro screening sialových kyselin ve vybraných glykoproteinech. Použití HPAE-PAD na Dionex CarboPac PA20 Fast Sialic Acid koloně umožňuje separaci Neu5Ac a Neu5Gc bez nutnosti derivatizace po kyselém hydrolýze.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Dionex ICS-3000/ICS-5000 Ion Chromatography system se SP/DP pumpou, DC detektorem a AS autosamplerem
• Elektrochemický detektor s jednorázovou Au/PTFE pracovní elektrodou a Ag/AgCl referenční elektrodou
• Thermo Scientific Dionex Chromeleon 7 CDS
• Suchoblockový ohřívač, nylonové filtrační jednotky, mikrocentrifugové mikrozkumavky a injekční vialky

Použitá metodika

Glykoproteiny byly hydrolyzovány 2 M octovou kyselinou při 80 °C po dobu 3 h a následně ředěny 1:100. Chromatografie probíhala na CarboPac PA20 Fast Sialic Acid koloně (3×30 mm) při 30 °C s gradientem 70–300 mM acetátu v 100 mM NaOH (0–2,5 min), 300 mM (2,5–2,9 min), návrat (2,9–3,0 min) a 1,5 min ekvilibrace. Průtok 0,5 mL/min, objem injekce 4,5 µL (full loop). Detekce pulzní amperometrií v cukerném vlnovém průběhu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila baseline separaci Neu5Ac (RT ≈0,74 min) a Neu5Gc (RT ≈2,58 min) během <3 min, celkový cyklus 4,5 min. Lineární rozsahy: Neu5Ac 0,27–68 pmol (r2=0,9995), Neu5Gc 0,23–11 pmol (r2=0,9997). LOD/LOQ: Neu5Ac 0,11/0,34 pmol, Neu5Gc 0,058/0,18 pmol. Retenční doba RSD <0,9 %, plocha piku RSD ~1,3 %. Analýza pěti glykoproteinů (fetuin, apo-transferrin, transferrin, hAGP, sAGP) prokázala množství sialových kyselin v souladu s literaturou a recoveries 81–96 % (Neu5Ac) a 82–106 % (Neu5Gc). Variabilita vzorků je způsobena optimalizací kyselé hydrolýzy a činidly matice.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlá vysokoprůchodová analýza bez derivatizace s nízkou spotřebou elučního roztoku a odpadem je ideální pro vývojové, výrobní a QA/QC laboratoře v biotechnologii a farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Optimalizace hydrolýzy pro různé glykoproteiny, integrace s enzymatickou liberací sialových zbytků, miniaturizace a automatizace přípravy vzorků a kombinace s dalšími chromatografickými či hmotnostními metodami pro komplexní profilaci glykosidických modifikací.

Závěr

Popsaná HPAE-PAD metoda na CarboPac PA20 Fast Sialic Acid koloně poskytuje rychlý, citlivý a přímý přístup ke kvantifikaci Neu5Ac a Neu5Gc po kyselé hydrolýze glykoproteinů, což podporuje efektivní screening a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Byrne B.; Donohoe G.G.; O’Kennedy R. Sialic Acids: Carbohydrate Moieties that Influence the Biological and Physical Properties of Biopharmaceutical Proteins and Living Cells. Drug Discov. Today. 2007;12:319–326.
2. Jenkins N.; Curling E.M. Glycosylation of Recombinant Proteins: Problems and Prospects. Enzyme Microb. Technol. 1994;12:354–364.
3. Kaneko Y.; Nimmerjahn F.; Ravetch J.V. Anti-Inflammatory Activity of Immunoglobulin G Resulting from Fc Sialylation. Science. 2006;313:670–673.
4. Du J.; Meledeo M.A.; Wang Z.; Khanna H.S.; Paruchuri V.D.P.; Yarema J.K. Metabolic Glycoengineering: Sialic Acid and Beyond. Glycobiology. 2009;19:1382–1401.
5. Klein A.; Diaz S.; Ferreira I.; Lamblin G.; Roussel R.; Manzi A.E. New Sialic Acids from Biological Sources Identified by LC-ESI-MS of SIA Quinoxalinones. Glycobiology. 1997;7:421–432.
6. Angata T.; Varki A. Chemical Diversity in the Sialic Acids and Related α-Keto Acids: An Evolutionary Perspective. Chem. Rev. 2004;102:439–469.
7. Varki A. Glycan-Based Interactions Involving Vertebrate Sialic-Acid-Recognizing Proteins. Nature. 2007;446:1023–1029.
8. Padler-Karavani V.; Yu H.; Cao H.; Chokhawala H.; Karp F.; Varki N.; Chen X.; Varki A. Diversity in Specificity, Abundance, and Composition of Anti-Neu5Gc Antibodies in Normal Humans: Potential Implications for Disease. Glycobiology. 2008;18:818–830.
9. Hokke C.H.; Bergwerff A.A.; van Dedem G.W.K.; van Oostrum J.; Kamerling J.P.; Vliegenthart J.F.G. Sialylated Carbohydrate Chains of Recombinant Human Glycoproteins in CHO Cells Containing Traces of N-Glycolylneuraminic Acid. FEBS Lett. 1990;275:9–14.
10. Hossler P.; Khattak S.F.; Li Z.J. Optimal and Consistent Protein Glycosylation in Mammalian Cell Culture. Glycobiology. 2009;19:936–949.