Ion-Pair Reversed-Phase Liquid Chromatography Method for Analysis of mRNA Poly(A) Tail Heterogeneity

Význam tématu

Vývoj terapeutických mRNA molekul jako vakcín proti SARS-CoV-2 a jejich využití v léčbě nádorových i genetických onemocnění klade vysoké nároky na analytickou kontrolu. Poly(A) ocas hraje klíčovou roli v odolnosti mRNA proti degradaci a efektivitě proteosyntézy, proto je nutné přesně charakterizovat jeho délkovou heterogenitu pro zajištění kvality a konzistence výrobků.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikované studie bylo navrhnout a optimalizovat iontovou párovou reverzní chromatografii (IP RP LC) s UV detekcí pro detailní analýzu délkové heterogenity poly(A) ocasu mRNA. Hlavními úkoly bylo:

• Uvolnění poly(A) ocasu RNázou T1 a de-fosforylace fragmentů.
• Separace dlouhých oligoribonukleotidů až do ~150 nukleotidů s n/n-1 rozlišením.
• Stanovení dominantní délky ocasu pomocí kalibrace syntetickým standardem.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Digesto RNázou T1 (Thermo Fisher) při 37 °C a následná de-fosforylace pomocí Quick CIP (NEB).
• Čištění od solí a nečistot na Oasis HLB µElution destičce (Waters).

Chromatografické podmínky:

• System: ACQUITY Premier UPLC se SM-FTN a QSM.
• Detekce: PDA, 260 nm.
• Kolona: ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 300 Å, 2.1×150 mm, 1.7 µm.
• Teplota kolony 60 °C, vzorku 10 °C.
• Mobilní fáze A: 100 mM octylammonium acetátu v 40 % acetonitrilu + 1 % HFIP.
• Mobilní fáze B: 100 mM octylammonium acetátu v 90 % acetonitrilu + 1 % HFIP.
• Gradient: 46 % A / 54 % B → 28 % A / 62 % B + 10 % acetonitrilu během 40 min.
• Flow rate 0.3 mL/min, injekce 1 µL.
• Software: Empower v3.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaná IP RP LC metoda dosáhla n/n-1 rozlišení až pro oligoribonukleotidy kolem 150 nt. Při aplikaci na RNázou T1 digesovaný standard EPO mRNA byla dominantní frakce poly(A) ocasu identifikována na ~124 nt, u Fluc Beta mRNA na ~128 nt. Délka byla odvozena z lineární kalibrace L(nt)=a·t_r+b na základě syntetického 100 nt oligo(A) standardu a jeho krátkých nečistot.
Strategie optimalizace zahrnovala volbu účinného alkylaminu (octylamin), vysokou koncentraci (100 mM), použití sub-2 µm fází a strmý šikmý gradient (0.25 % acetonitrilu/min). Vyšší koncentrace IP činidel by vyžadovala extrémní acetonitril, což může vést k precipitaci nukleových kyselin.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduchá UV detekce vhodná pro rutinní QC testy.
• Robustní stanovení délky a heterogenity poly(A) ocasu.
• Možnost doplnění LC-MS nebo SEC UV pro potvrzení výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro zjištění sekvenčních modifikací.
• Vyšší průtokové automatizované platformy pro screening více vzorků.
• Vývoj stacionárních fází pro lepší rozlišení ultra dlouhých fragmentů.
• Rozšíření metody na jiné druhy RNA (např. siRNA, lncRNA).

Závěr

Navržená IP RP LC-UV metoda s octylammonium acetátem a širokopórovou C18 fází umožňuje spolehlivě analyzovat délkovou heterogenitu mRNA poly(A) ocasu až do ~150 nt. Metoda je vhodná pro rutinní QC a doplňkovou analýzu vedle LC-MS či SEC.

Reference

1. M. Donegan, J.M. Nguyen, M. Gilar, J. Chromatogr. A, 1666, 462860 (2022).
2. M. Gilar et al., J. Chromatogr. A, 958, 167–182 (2002).
3. S.G. Roussis, M. Pearce, C. Rentel, J. Chromatogr. A, 1594, 105–111 (2019).
4. G.J. Guimaraes et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 208, 114439 (2022).
5. A. Goyon, P. Yehl, K. Zhang, J. Pharm. Biomed. Anal., 182, 113105 (2020).
6. T. Jiang et al., Anal. Chem., 91, 8500–8506 (2019).
7. V.B. Ivleva, Y.Q. Yu, M. Gilar, Rapid Commun Mass Spectrom, 24, 2631–2640 (2010).
8. L.T. França, E. Carrilho, T.B. Kist, Q. Rev. Biophys., 35, 169–200 (2002).
9. E. Carrilho et al., Anal. Chem., 68, 3305–3313 (1996).
10. M. Gilar et al., J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 714, 13–20 (1998).
11. J.R. Thayer, Thermo Scientific Application note 21996 (2014).
12. C.G. Huber et al., LC-GC, 14, 114–127 (1996).
13. M. Gilar, U.D. Neue, J. Chromatogr. A, 1169, 139–150 (2007).
14. S.M. McCarthy, M. Gilar, J. Gebler, Anal Biochem, 390, 181-188 (2009).
15. J.M. Nguyen et al., Bioanalysis (2021).
16. M. Gilar, M. DeLano, F. Gritti, J. Chromatogr. A, 1650, 462247 (2021).
17. M. DeLano et al., Anal. Chem., 93, 5773–5781 (2021).